qpcr异常结果

goblinwang

请教各位大侠，qpcr结果为啥会是这样，下面两张图显示的是目的基因的扩增曲线和溶解曲线，

2013-8-20 20:08 上传

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2013-8-20 20:08 上传

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随后我对该基因的PCR产物进行电泳

2013-8-20 20:11 上传

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，最后我进行CT值分析的时候软件却显示未检测出信号，无法给出CT值，很是奇怪，虽然扩增曲线不好，但是溶解曲线和电泳图谱显示的结果和我预计的差不多，尤其是电泳条带大小和预计的一样，，，想请各位大侠帮忙分析下原因，仪器是AB公司7500，软件也是配套的，很是费解啊，求解释，先谢过各位了，

fay898

模板浓度太高了~~引物特异性应该没问题~最好把逆转录的CDNA稀释了，再PCR~~5 R+ i% q4 U, H2 z: x' ]
拙见~

86964109

同意楼上

Jonathan

2楼解释的是。模板浓度高，这样你所看见的扩增曲线，就不是在一个对数期。

goblinwang

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1 D+ s% T  N  |  P0 C& K* n- j5 [) p; H# e6 P
谢谢你的回复，CDNA的浓度是100ng,我的内参就没这个问题

2013-8-21 15:54 上传

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，刚开始我以为是目的基因本底表达低，所以扩增慢，但是看到电泳图后，我觉得不太可能，毕竟产物条带挺亮的! w1 N2 C' X. ]9 w/ X5 O: Z

fay898

回复 goblinwang 的帖子
7 u3 ^# t3 j7 y3 c& L- E4 x/ J, k. y% P3 \1 }! b$ {  u
一般CT值最好控制在18-38，过低，说明DNA浓度太高，适当稀释；过高，说明DNA浓度低~~一开始要摸一下浓度的~

goblinwang

回复 fay898 的帖子
( t* n' |7 {. W; p) V
% m2 r4 R  y! P% e; J9 [( L, p谢谢赐教，目前我用100ng模板做的所有基因都在这个范围内，除了这个异常的，所以求教各位了，解释什么原因。

hormone008

回复 goblinwang 的帖子4 H2 @# U7 J- A& D1 _' p

9 z* G% F9 G$ m; m4 `3 t# Z个人认为：你的模板太低，几乎没有，导致的现在这个扩增曲线！4 w! F# K% t; D8 J/ ?) h  u, i
你重新逆转录吧！

goblinwang

回复 hormone008 的帖子- j9 L- [7 s2 ^; m$ }
2 X: i! e8 E1 }: X: d
谢谢，可能我下次做得要将这个基因单独处理，提高浓度，同一批处理其他基因都挺正常，这表达量低，应该是与其本底表达低有关，下次我试试。谢谢了

redmaple

你做qPCR时，目的片段的大小是多大？