western blot出现这种结果是什么原因？谢谢

daviddow

最近的试验western blot出现了这样的结果。大家帮我看看是什么原因？谢谢" S& b6 }  U) s: t- K( M  y* j
1：是不是裂解的时候过长？& s0 h& x7 a) Z
2：是不是SDS-PAGE电泳的时候电泳液出现了问题？

daiying5200000

曝光没弄好吧

app_1983

不知道你的实验条件是怎样的，一抗是单克隆抗体还是多克隆抗体，单从这张片子看起来的话，感觉跟电泳液的关系不大，像是封闭过程没做好，出现了非特异条带及背景；另外你想要的是哪条条带呢，如果是想要上面的条带，而不是最下面较黑的条带的话，那就有可能裂解的时间过长，导致蛋白降解较多。

innatestem

1.能不能说一下你的裂解条件？
+ W, [# C- S  d( T& B3 s/ p( n2.可能与你的转膜条件有关，你用的是干转还是湿转？/ ]* ?7 a: X- n4 D: m9 ?: h# p$ x
3.有可能是你的一抗浓度不太合适。( c% k# r* I1 W- Z, Y! ?
4.用PBST/TBST多洗一两次。) B: b0 C4 d8 H/ z% W% E
5.曝光的时候控制一下曝光的时间

jackywangzr

由于不知道你的试验条件，不好判断。* ~% _' v8 u/ E- G# d7 |
但是出现这样的条带是不是你用的是多抗啊？？特异性太差。
. `" Z% e# i0 w$ [4 \9 v$ q如果以前做过的话建议洗的时候加长时间，加大次数，效果会很好的。

susuloveq

应该是胶没配好

meister

回复 daviddow 的帖子
, r( I4 y" v. Z0 w( B6 T  n8 J
应该不是抗体的问题，也不是胶的问题。, {. j9 O& T" Y- ]& b5 u

+ {6 P1 n8 p& F$ C+ M  E" y我估计最大可能是蛋白样本制备的问题。有可能蛋白浓度过高，或者DNA裂解不完全。

懵懂干细胞

2013-9-29 19:02 上传

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你看我的也出现这种情况，开始我没太在意，以为下次蛋白制备，制胶和电泳等严格点就会OK，结果又出现了，) V3 p( N4 W9 q+ f3 d
我现在怀疑的原因有两个，第一：是蛋白浓度过高，第二：是裂解时间或者强度有点过了！8 `# [! V! Y# N
我准备重新提取下蛋白试一试！ 如果哪个高手遇到此种情况，还望赐教解决方案，省走弯路！

懵懂干细胞

http://emuch.net/html/201010/2445729.html 这是小木虫的一个战友求助的帖子 出现的问题可能差不多，可以参考下人家是怎么解决的
7 N- v6 n) ^) s/ o! Y如下：
& P# D& \) T9 ?9 |" h同志们，偶的问题解决了。
+ g; E/ p) M/ D% t' n6 _ 1、偶重新配制了loading buffer；# `/ V8 r* f9 h/ O
2、裂解完细胞后取了部分上清做蛋白定量，然后立马加了等量loading buffer
7 \' _2 S# W; c7 r! b 。以前偶都等定量结束才加的loading buffer；; Z/ X+ }% u& C9 O! t4 f) d
3、偶每次上样前，也有离心哦：
0 F5 v/ b) s9 m- Q6 S5 ]1 T9 I 4、一切程序一定要在冰上进行。

懵懂干细胞

顺便问一下：会不会是没浓缩好啊？