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你这个现象显然不正常。3 d! J5 m. U V! d0 ?7 T6 S
分享一下我们实验室采用的protocol:
* Q8 o2 P6 r( Q通过EB途径将hESC定向分化为心肌细胞。! U* M+ G* F; N8 \' X) k
1. 心肌分化前细胞培养的准备& F K% g$ c; c* S
（1）在开始分化前，hESC至少在标准密度（0.75×10^5个细胞/ml）的MEF上传代3次。3 z- c/ ]" Z# N0 j5 u( v' F
（2）在EB形成前1代，hES细胞需传至低密度(0.5×10^5个细胞/ml) MEF上培养3-5天。
0 U) `% {" n: C0 x0 V* V2. 心肌分化第0天
6 m% o9 M4 z' A- Z4 \) F（1）待分化的hES细胞培养3-5天后，用分散酶/胶原酶Ⅳ消化。4 }' u. E' Q" ?. E5 g
（2）将培养板置37℃，5%CO2培养箱孵育20-30min，直到轻摇培养板所有细胞克隆从培养板上脱落，漂起。
% N Q3 U; P% V. H& ^1 K# u（3）用1000 μl大tip将细胞克隆轻轻吹下，尽量保持克隆的完整性，将漂起的克隆吸入15ml离心管。! z, q- G, P" y9 ^" f7 j
（4）毎孔加1ml EB20培基冲洗培养孔，并将其吸入15ml离心管。
5 o. M8 D) l& ?7 b+ d3. 心肌分化第1-3天
5 U8 v/ y& u% ?# f5 m1 T; e5 @$ Q# l: C" |（1）第一天，将培养板内EB吸至15ml离心管，自然沉降2-3min后，小心的吸弃上清，再加6ml EB20培基重悬细胞。' s0 z0 @2 h- t1 n+ `
（2）在低吸附6孔板的每个孔加4ml EB20培基，然后毎孔加入（1）中的细胞悬液1ml,最终培养体积为5ml。
6 j7 `. B2 k- R7 b j' x（3）继续悬浮培养EB 2天，无需换液。
* Q; h9 d4 Y( F+ A（4）在第3天，准备0.1%的明胶包被培养板，室温包被过夜。
3 ]: [- h1 n7 w2 p+ q/ s+ W( h) C4 I（5）将细胞克隆在重力作用下自然沉降2-3min。
" X6 J3 B' @' Q; A7 r7 v, P（6）轻轻的吸弃培基，用5ml EB20分化培基洗涤细胞克隆，至少洗涤3次，每次都让细胞克隆自然沉降。0 y! {2 h' r0 g
（7）毎块6孔板的细胞克隆加6ml EB20培基重悬细胞。
) L# ]8 t) f& B9 ]6 w（8）在低吸附6孔板的每个孔加2ml EB20培基，然后毎孔加入（7）中的细胞悬液1ml。/ ~# s# W7 X) _3 K) Y
4. 心肌分化第4天' }; s. M; _/ U9 O. ?
（1）将EB从低贴附培养板吸至50ml离心管。
) [' ]+ o& O3 L（2）将6孔板的明胶弃尽，毎孔加入EB悬液1.5ml。7 w+ N V2 n- y3 D5 v
（3）毎孔再加入1.5ml新鲜的EB20培基，轻摇培养板，使EB均匀分布于培养孔
% y( ?, d2 K/ c4 l8 {" P5.心肌分化第5天
3 M3 _5 t$ \$ x 每个培养孔加入1ml EB20培基。
* ^' v6 E) T. G$ P$ h9 m. L w6.心肌分化第6天! d+ x1 `; W3 [3 I
吸弃原培基，毎孔更换3ml新鲜的EB20培基。每天都更换培基至分化第10天。
1 D. J: `/ ]! r* ]7. 维持培养
5 M8 r# }2 w/ R9 {2 E' {( K0 O EB20培养基用于EB形成的前10天培养，然后用EB2培养基维持EB的培养；前20天每天更换培养基，20天后根据EB的密度适当减少更换培养基的频率。在心肌分化的第11-15天，陆续可以观察到类似心肌跳动的细胞克隆，且数量逐渐增加。
+ I2 J$ ? d3 C1 V
1 c2 Q" y1 C% g# d$ D培养基配方：
* r, q( l3 H9 }$ Z3 G1. EB20分化培养基
; |. H( ~; Z. \" s# eDMEM/F12 392.5ml" B& J v0 O& V9 E0 a9 o* H
FBS 100ml
# B. a5 v4 B. ]$ E) k: a- M* b0 F3 V200mM L-谷氨酰胺 2.5ml
" x; Z" ^/ Z7 s" M9 Hβ-巯基乙醇 3.5μl
7 B N1 s+ W5 I" A' X非必须氨基酸 5ml
+ F9 \+ p: K/ a# Z0 d5 o* F7 X7 t) s+ y
2. EB2培养基（500ml）
' Q) \5 l% Q: r8 |0 E QDMEM/F12 482.5ml/ u0 a+ R2 P- X7 b, H
FBS 10ml
7 b# g6 [( Z! U9 r0 n4 v* V200mM L-谷氨酰胺 2.5ml* `5 y' U1 N+ L' y# X _- ]5 L
β-巯基乙醇 3.5μl+ P1 v5 I- P: K ]: F
非必须氨基酸 5ml$ n- M' j u2 `+ A3 e
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发表于 2014-3-28 17:47
发表于 2014-4-1 07:38
