求助：PCR上下引物如何设计？

a279915845

我做的是大鼠诱导的iPS，想做PCR进行鉴定，上下引物该如何设计，求赐相关文献，初学者求赐教

nichifanlema2

回复 a279915845 的帖子, ~/ Q# U" ^% B7 s

' n9 w% E/ ^, }, g, N: {$ v4 v最好是用文章上现成的引物，直接让公司合成即可。如果想自己设计，需要查询到基因，然后可以利用软件如Primer 5或以上版本，设定参数后就可以。

Andyhigh

a279915845 发表于 2014-3-31 17:30 % K: |  P: P. D" l
我做的是大鼠诱导的iPS，想做PCR进行鉴定，上下引物该如何设计，求赐相关文献，初学者求赐教

! ^& y/ b- ^* s5 G/ Z7 m( Y  [我来回答下你的问题：
: N- K* Q* R9 j- q$ u; Q1 ]9 H2 b, k: c+ u
1. 请说明你鉴定的目的；如你的问题给人以歧义，是想鉴定某个基因是否表达，还是想区分内 外源性基因是否表达或者沉默，让别人不知道如何回答你。: Q0 M1 z  R* K! Y
( C! A1 V( {1 Q' m/ _" d" W
2.正如楼上所说，你可以找 文章中现成的引物，不过文章的质量最好高点，并且跟你的试验目的是一样的，同时注意种属问题。
& e$ h% ]! u8 h- O6 A/ |. Z- k! W$ [* I% O
3. 如果你想学习引物设计，你可以在百度搜索下，有很多这方面的基础知识，如引物设计的基本原则，另外还推荐几个论坛：小木虫、生物秀。 掌握基础知识后，最好找个会用PRIMER 的师兄师姐教你一下，这样上手就快了！
" E; R" X$ |, Q+ e+ K1 s0 E; r
( K$ x8 {, _6 ?; I* o3 \2 R补充内容 (2014-3-31 21:15):
( K# n* q  I. \9 g. V& V还有丁香园你也可以关注下，这些东西就是要你静下心来好好学，上手还是很快的！！！

nines

大体上有以下原则：+ {3 M+ U2 r* I+ D- |; Y0 j* G
1 引物长度大于16bp,一般为20-24个核苷酸5 F+ I& A. k, _8 z1 s- C/ z6 q7 C
2 引物与靶序列间的Tm值不应过低
2 I  E5 _: x& a4 m7 ~, v3 引物不应有发夹结构。即不能有4bp以上的回文序列4 q# D1 K( S, ?/ x
4 两引物间不应有大于4pb以上的互补序列或同源序列，在3’端不应有任何互补碱基
6 |5 D- W7 M  u# [: o" G: n5 引物中碱基的分布尽可能均匀，G+C含量接近50%
. {5 ?6 d8 e* V, R$ ^* Y要先在NCBI上查找你的目的基因序列，然后用引物设计软件PRIMER（现在好像有PRIMER6了）等，也可以在线设计Primer3 – Free Online Primer Design Tool | PCR Primer Analysis Software
# Q+ s' X9 d, ~- k  d* p& S( v% f1 Whttp://simgene.com/Primer3；上面的参数不要改，设计出来会有好几对，让老板或者师兄师姐帮你看一下挑一个最合适的就行啊，然后送公司合成，很快的。

碧螺春的秋天

检测内源基因表达还是外源基因沉默？内源基因的话就在基因的上下游各按照楼上的描述设计引物，如果是外源基因沉默的话就在载体上游和基因下游设计引物，进行PCR检测。