Nature成功实现干细胞靶向基因组编辑（附原文）

坤明

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时间：2014年5月29日 来源：生物通
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; ~4 u1 e4 ~8 t4 s/ H6 Y6 P生物通报道  来自意大利San Raffaele科学研究所的研究人员，在人类造血干细胞（HSC）成功实现了靶向基因组编辑，这一突破性的成果发表在5月28日的《自然》（Nature）杂志上。8 r0 z5 }! u$ X; }' R$ I+ M/ ^2 p. D( `
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基因治疗为一些因基因缺陷引起的遗传性疾病提供了良好的治疗效果。然而传统的方法是采用一种遗传工程载体将突变基因的一个功能拷贝传送到病变细胞添加到基因组中。尽管更为先进的载体，例如慢病毒载体证实提高了安全性和疗效，利用半随机插入载体存在的插入突变及失控性转基因表达风险仍然令人们感到担忧。这些不良效应有可能会触发癌症形成、毒性作用或破坏基因修饰细胞。
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锌指核酸酶(ZFNs)、转录激活因子样效应蛋白核酸酶(TALEN)和RNA引导核酸酶(CRISPR/Cas)等人工核酸内切酶为基因打靶实现基因治疗效应带来了可能性。利用这些核酸酶可以有效和特异性地对基因组进行靶向编辑，使得能够将表达组件整合到安全的基因组位点，或是通过在受累基因启动子下游插入一个功能性的拷贝纠正致病突变。相比于基因替代，这种基因修正不仅能够修复功能，还能够恢复基因的生理表达，这是基因治疗长期追寻的一个目标。- a+ J; M! a2 G3 v; z8 k9 w* p

, A1 M- Y; R5 c. d4 T在基因治疗中，造血干细胞因为具有自我更新及分化为各种细胞系的能力而成为一种很有吸引力的靶细胞。近年来，将外源目的基因导入造血干细胞，以纠正或补偿基因缺陷和异常引起的疾病，特别是血液疾病如腺苷脱氨酶缺陷病、血友病、地中海贫血症及镰状细胞贫血症中已取得重要的进展，然而，在造血干细胞中实现靶向基因组编辑却仍然是一个难题（延伸阅读：Science：基因治疗的时代来临 ）。2 U& s6 L5 G+ w% j

  N5 S/ U  a2 {* \; U在这篇文章中，研究人员发现其障碍在于同源重组只发生在周期细胞中（细胞周期的S/G2），因而导致了在诸如HSCs一类的静息成体干细胞中进行这种基因组编辑操作效率低下。通过采用特异的传送平台和培养条件他们克服了这些障碍。
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. Q( w3 I: F4 R" U7 l* tGenovese和同事们首先用一些细胞因子对细胞进行了2天的预刺激，在第二天时利用一种病毒载体导入了重组模板。他们随后利用电流对细胞进行对细胞进行了渗透性处理，然后添加设计的锌指核酸酶靶向目的DNA序列。用细胞因子进行预处理使得细胞对于导入核酸酶的毒性效应变得不太敏感，更重要的是这种处理促使一些细胞进入到细胞周期能够介导同源重组。此外，研究人员还用两种芳(香)烃受体蛋白抑制剂dmPGE2和SR1处理了细胞，阻止了它们过早分化，使HSCs处于干细胞状态。
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) j( J' Z$ D4 C7 g  |这一实验方案使得Genovese等在一些HSCs中实现了位点特异性基因组编辑，将修正互补DNA靶向到了HSCs细胞的IL2RG基因中。IL2RG是X-连锁重症联合免疫缺陷病(SCID-X1)的致病基因。当他们将这些处理细胞转移到免疫缺陷小鼠体内，证实基因编辑HSCs可以维持正常的造血并生成了功能性的淋巴细胞。+ g) B  t+ i6 |
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研究人员表示，这一突破性的成果为治疗SCID-X1和其他基因缺陷疾病开辟了一条新途径。
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（生物通：何嫱）
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6楼原文 感谢hkenb提供

坤明

Targeted genome editing in human repopulating haematopoietic stem cells
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: L- V# ?7 |2 J3 L6 j" YTargeted genome editing by artificial nucleases has brought the goal of site-specific transgene integration and gene correction within the reach of gene therapy. However, its application to long-term repopulating haematopoietic stem cells (HSCs) has remained elusive. Here we show that poor permissiveness to gene transfer and limited proficiency of the homology-directed DNA repair pathway constrain gene targeting in human HSCs. By tailoring delivery platforms and culture conditions we overcame these barriers and provide stringent evidence of targeted integration in human HSCs by long-term multilineage repopulation of transplanted mice. We demonstrate the therapeutic potential of our strategy by targeting a corrective complementary DNA into the IL2RG gene of HSCs from healthy donors and a subject with X-linked severe combined immunodeficiency (SCID-X1). Gene-edited HSCs sustained normal haematopoiesis and gave rise to functional lymphoid cells that possess a selective growth advantage over those carrying disruptive IL2RG mutations. These results open up new avenues for treating SCID-X1 and other diseases.

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可以用来治疗艾滋病！

fguw

能不能发个全文，这个应该说还是解决一个技术问题，因为血液病很重要，所以引起重视是自然，
2 J, B  q  j; j( t$ k谢谢

hkenb

这绝对是一个重磅突破，如果能够被其它实验室重复出来的话！

hkenb

原文

fguw

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我们也关注过这个细胞，但是，从这个文章都到临床还极其漫长，所以不是一篇NATURE 可以搞定的；之所以能够发NATURE，还是实现了功能的恢复；但是，这里面有很多问题；比如，人的细胞体外培养后可能根本无法种回去，另外，基因修复效率可能异常低；修复过程中基因组的精确性，有无脱靶等等都是一堆问题需要回答；动物没有关系，怎么操作都可以，但是临床就不是一回事，必须要求异常好。

Damon-Salvatore

补充一下 扩展阅读 Science 基因治疗的时代来临  的内容和文献：1 R' J6 j7 S' W5 _% ?  X; [
研究人员报道称，他们在针对两种不同罕见疾病的基因治疗试验中取得了有希望的研究结果。研究小组利用携带功能性基因的慢病毒载体，替换了患者造血干细胞(HSCs)中的突变拷贝，然后将这些基因矫正细胞重新输回到患者的体内。在治疗18-32个月后，患者体内高百分比的血细胞得到了遗传矫正，阻止了疾病的进程。
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6 z8 w1 s$ m; S0 t并且没有证据显示，载体以可能引起白血病的方式，将遗传物质导入到了宿主基因中——在过去采用逆转录病毒的人类基因治疗试验中就出现过这种不良的结果，导致基因治疗一度陷入困境。
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尽管研究人员表示还需进行长期的随访，这两项发表在7月11日《科学》（Science）杂志上的研究表明，慢病毒基因治疗是治疗某些疾病的一种安全有效的方法。
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0 b, \6 [0 v8 s+ g% N2 H3 r两篇论文的共同作者、意大利San Raffaele-Telethon基因治疗研究所(TIGET)主任Luigi Naldini说：“现在，我们通过安全地整合治疗基因，从多方面操控了人类血细胞生成。”3 {+ p2 W# [& ?* ~
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法国国家医学与健康研究院(INSERM)儿科神经学家和基因治疗专家Patrick Aubourg（未参与该研究）说：“看到这两篇论文，我感到非常的高兴，因为它们是如此的鼓舞人心。这项工作确实地证实了，随着病毒载体得到改良，基因治疗的时代即将到来，其将被视作是许多疾病的一种有效的治疗方法。”+ V/ A! |/ E5 K( f* g

0 X4 n" l- J# g7 w- S  z# r如何克服基因治疗应用在临床上的难题
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间接体内基因治疗有潜力用于治疗多种疾病，然而一直以来由于基因转移效率和安全性等问题，阻碍了其临床应用。基因治疗面临的一个主要问题是具有致癌倾向。由于病毒可将自身的遗传物质几乎随机地插入到宿主基因组中，因而治疗基因旁边的启动子序列有时候可能会激活邻近的致癌基因。, B7 F& j7 I( R2 m" p; r: M5 D
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为了克服这些障碍，研究人员转而借助于以慢病毒载体为基础的载体。通过改造慢病毒载体，不仅可以提高基因转移的效率，还可以避免将专门诱导治疗基因表达的自失活启动子序列装载到载体内，导致致癌基因激活的风险。
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! o4 a! @3 @( {2009年，Aubourg和同事们发布了一项开创性试验的结果。他们针对HSCs开展以慢病毒为基础的治疗，第一次治疗了一种累及年轻男性的神经变性疾病：X-连锁肾上腺脑白质营养不良（X-linked adrenoleukodystrophy ,ALD)。在接受治疗2年后，患者的许多免疫细胞携带着矫正基因，疾病进程完全终止。并且，研究人员在细胞中观察发现了各种基因整合位点，但没有迹象显示有致癌基因激活。
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Naldini 说：“相比于从前的方法，它取得了重大的进步，能够更有效更安全的实现基因转移。但推动间接体内基因治疗从实验室进入到临床，还需要更多的证明。”
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* w) b- y% @1 s" T在最新的研究中，Naldini和同事们证实，进一步改进慢病毒载体设计，可以提高基因改造细胞的数量。在第一项实验中，由TIGET的Allesandra Biffi领导的一个研究小组，治疗了3名患有异染性脑白质营养不良（metachromatic leukodystrophy ,MLD)罕见溶酶体贮积症的儿童。MLD是一种由芳基硫酸酯酶A（arylsulfatase A，ARSA）编码基因突变引起的神经退行性疾病。当前，没有方法能够成功治疗MLD，患者通常在数年内死亡。
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研究人员将一个功能性的ARSA基因转移到来自9名症状出现前MLD患者的HSCs中。一名患者在接受改造HSCs治疗2年后接受了分析检测，而另外2名患者则在治疗18个月后接受了分析检测，结果显示45-80%的血细胞携带着功能性基因。芳基硫酸酯酶A在这些细胞中和脑脊髓液呈正常、健康水平表达。并且在患者通常表现症状的时间点过去很久之后，都未见疾病有进一步的进展。Naldini说：“在这一阶段，患者通常会出现脑损伤或是死亡，但现在他们活得好好的。”% {" K0 Z1 U4 e+ c
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在另一项研究中，TIGET的Allesandro Aiuti领导的一个研究小组，采用相同的方法治疗了3名患有维-奥二氏综合征（Wiskott-Aldrich Syndrome，WAS）的儿童。WAS是由WASP蛋白编码基因突变引起的一种罕见免疫缺陷疾病。治疗20-32个月后的分析结果显示，20-25%的靶血细胞得到了遗传矫正；3名患者的免疫系统基本恢复；反复湿疹感染等症状减轻或完全消失。
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( d( J' |4 O; L6 }3 n! d最重要的是，在两项研究中，分子分析HSC子细胞的基因整合模式，没有证据表明载体正激活癌基因。“这些慢病毒载体似乎没有引起逆转录病毒载体治疗中所看到问题。这是一个极好的证据，表明它们更加的安全，”Naldini说。( N) |: f% x+ y9 J0 w

$ ?8 B3 ]7 V; jAubourg说：“当然，我们希望得到一种载体，它能够整合到宿主基因组中我们知道不会造成不良影响的位置。现在，它看起很安全。有了这些改良的慢病毒载体，基因治疗应该再也不会让人们望而却步了。”, ]" m# e" `3 Z' o3 l4 ]7 ^; G
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