关于RT-PCR

moluxingke

最近在做反转录PCR，组织提取RNA，然后反转cDNA，稀释大约500以后再做普通的PCR，用了36个循环，结果跑电泳的时候发现GAPDH亮度差异很大，按理来说，用1ug的RNA反转，cDNA含量应该差不多的，但是经过PCR之后内参差异怎么会这么大，有时候做Real time也是这样，同样的RNA反转之后，GAPDH的CT值有的是15，而有的就是16了。提RNA后测浓度有的大于1500ng/ul，也有的不到500ng/ul，是不是反转的时候把RNA浓度调到一样的浓度会好点？除了反转的时候加样不均，或是RNA里面有DNA污染外，还有其他什么因素会导致内参不齐？请不吝指教？谢谢

小等

不同模板的CT值差1,2个，属于正常现象吧，这就为什么要做内参的意义吧

jiojoo

ct值15和16，其实不能算作有明显差别$ K5 h# k. Q* J9 F8 `
因为影响ct值的因素太多了
1 V9 Z: V6 v* S% L% {! ]5 w6 u不知道你测量RNA之前，有没有跑过RNA电泳，RNA中混有基因组的差异，RNA完整性的差异，反转时反转录酶反转效率的差异都会造成内参ct值的变化$ b2 Z2 o+ j# X$ s
反转时，为了尽量准确，是要把RNA的起启量控缺在一致的水平比较好
9 K, s7 ~  d+ |# X3 n8 N/ u不过还有一点是，GAPDH也不是说完全稳定的
: Y) E" g6 i0 X4 w  v给你一篇相关文献看一下吧
% Y) [5 @5 D+ ]8 l- N' C5 Uhttp://www.plosone.org/article/i ... ournal.pone.0064786

moluxingke

回复 小等 的帖子
( |# ?7 [  r3 i1 e$ X
* k$ ~! }# n: ~$ c! e- a' Q嗯，有道理，不过我现在都是把提取的mRNA稀释到相同的稍微比较低一点的浓度，一般500左右，这样加样导致的误差尽量减少，反转后做QRT的CT值基本一致，一般不会相差到2.大多情况下基本一致。

moluxingke

回复 jiojoo 的帖子7 ^/ W* G. @0 v) p- l$ r0 x
6 @3 H! C1 Y- m( F' P: L! I
谢谢帮助，现在做反转录之前，我都是把RNA的浓度调到大致差不多，情况明显有好转。

zarecol

再给你一点建议：平行试验用一个牌子的试剂盒