石蜡切片之免疫荧光

yeshch

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5 X1 q( E* X: N' S( _4 F请问那个前辈可以给小弟讲解一下免疫荧光的详细原理呀？尤其是加一抗、二抗的注意事项及操作细节技巧~兄弟多谢了！

moluxingke

这些其实有着和做western差不多的原理，首先都是利用一抗识别抗原，也就是你要检测的靶蛋白，然后用二抗结合一抗，起到一个信号放大的效果，因为二抗上带有荧光标记基团，在特定波长的激发光照射下，就发出特定波长的荧光。其中的注意事项，说多也很多，说不多也不多，主要就是保证组织不要放置太久，以免蛋白降解过度，另外抗体好用最重要，特别说明一下，如果做双标，那么一抗就用不同来源的，比如一个是兔抗，那么另外一个抗体就不要用兔抗了，以免二抗不能特异识别，并且二抗的荧光标记也不能一样。知道大致原理之后先试做一遍，就有个大致的概念了，反正很多细节问题都是在实践中发现的。祝你顺利

yeshch

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6 N$ s8 ]4 _# i5 n6 [OK，thanks！

jieniao1

我给你我做的一个protocol吧，一抗是不同源，还有前期根据抗体的要求做不同的处理就行了。0 d' g5 a2 C3 _! ^3 [
Double immunofluorescence for CNPase and GFAP on fixed paraffin-embedded tissue sections.% r3 a  G/ `7 r5 @, U
1.        Deparaffinization (2×3 min, Roticlear; 1×3 min, isopropanol; 1×3 min, 96% ethanol).# W) k* e2 L2 e6 |/ r  n, ]
2.        Incubate tissues in 0.5% H2O2 solution, 30 min, RT (inactivation of endogenous peroxidase).
* S' G! Y; d) g. X+ m0 L3.        Rinse tissue with PBS, 1×5 min.
% h4 k% R& w0 F4.        Boil tissue in citrate buffer in microwave pretreatment, 20 min (antigen demasking).* C7 {7 v7 Q! K3 ]/ S
5.        Rinse tissue with PBS, 3×3 min." a9 h! b0 s$ m4 e* m  R! Z
6.        Incubate tissue in 20% goat serum, 30 min, (blocking of unspecific antigens).
- n4 U: G5 ]! i7.        Incubate tissue with both primary antibodies (CNPase, mouse, 1 : 100; GFAP, rabbit, 1 : 1000), 1 h.
$ }2 x5 q- u! v8.        Rinse tissue with PBS, 3×3 min.$ B) F( l& q1 `8 C$ T3 d
9.        Incubate tissue with both secondary antibodies (goat anti-rabbit Cy2, 1 : 200, goat anti-mouse Cy3, 1 : 200), 1 h, RT.
$ _4 r: C- \. @10.        Rinse tissue with PBS, 3×3 min.
! ~6 G: ~; y% r( `8 B11.        Incubate cells with bisbenzimide solution, 10 min, RT.
4 j& J. \7 `5 B12.        Rinse tissue with PBS, 3×3 min.
2 @2 L" ]- N( X: f  }13.        Rinse tissue with distilled water, 1×5 min.) C. i  n# ~2 p- }
14.        Mount slide with Roti ®-Histokitt II mounting medium.
% p: ]4 ?% D) ~: L) Q

yeshch

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2 {5 j* _. X* _$ {, s2 R- Y
' @0 Q+ p; E2 Kthanks a lot!i will make an attempt.

yeshch

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6 O! B' X% j4 h& q0 Z( c, ]4 T4 n切片的时候，切出来的蜡条褶皱很严重，而且经常展不开是怎么回事？还有就是材料很容易就跟周围的蜡分离，甚至材料在展片后总是有空洞。还望多指教!

moluxingke

回复 yeshch 的帖子# U+ M! n. |: U" }4 d
2 P( ?: E. f/ m! O1 A: E
蜡片起皱一个原因是刀片钝化。建议及时更换新刀片，另外，有时候全新的刀片也会出现类似现象，这个时候需要将蜡块在冰上预冷一下，然后切片。时不时的用口对着蜡块哈气，这样切出来的片子就没有那么皱，展片时，在载玻片上滴加几滴70%酒精，然后将切好的切片放上去，再转到水槽里面，利用酒精张力，利于展片。展片水温可以适当提高一些。
& n3 O/ j3 {* q+ u& B/ ?关于第二个问题，主要是你包埋的时候组织过冷，和周围的蜡没有很好的融合，所以包埋要快，在没有包埋之前，组织最好浸在融化的石蜡里面。 意见仅供参考，也可能还有其他原因，逐个排除吧。

yeshch

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* ]* P+ ?) P& q
非常感谢你的指导，我再试试看