石蜡切片之免疫荧光

yeshch

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$ I& b. c( s- c请问那个前辈可以给小弟讲解一下免疫荧光的详细原理呀？尤其是加一抗、二抗的注意事项及操作细节技巧~兄弟多谢了！

moluxingke

这些其实有着和做western差不多的原理，首先都是利用一抗识别抗原，也就是你要检测的靶蛋白，然后用二抗结合一抗，起到一个信号放大的效果，因为二抗上带有荧光标记基团，在特定波长的激发光照射下，就发出特定波长的荧光。其中的注意事项，说多也很多，说不多也不多，主要就是保证组织不要放置太久，以免蛋白降解过度，另外抗体好用最重要，特别说明一下，如果做双标，那么一抗就用不同来源的，比如一个是兔抗，那么另外一个抗体就不要用兔抗了，以免二抗不能特异识别，并且二抗的荧光标记也不能一样。知道大致原理之后先试做一遍，就有个大致的概念了，反正很多细节问题都是在实践中发现的。祝你顺利

yeshch

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) ~' y1 ]& l6 N) z  ?; m6 P! IOK，thanks！

jieniao1

我给你我做的一个protocol吧，一抗是不同源，还有前期根据抗体的要求做不同的处理就行了。% e* [1 }8 P& x6 i9 T) A& ?
Double immunofluorescence for CNPase and GFAP on fixed paraffin-embedded tissue sections.+ ^- y& k# }( F, L4 B9 N/ y2 r
1.        Deparaffinization (2×3 min, Roticlear; 1×3 min, isopropanol; 1×3 min, 96% ethanol).
5 S- ~& v2 G4 E4 @9 a2.        Incubate tissues in 0.5% H2O2 solution, 30 min, RT (inactivation of endogenous peroxidase).
( U* e' a1 L: y$ ?2 V  `2 R3.        Rinse tissue with PBS, 1×5 min.
. Q( r- C$ F; Q4 K5 U/ Z# b0 s4.        Boil tissue in citrate buffer in microwave pretreatment, 20 min (antigen demasking).
- m- I) h/ l; T. l5.        Rinse tissue with PBS, 3×3 min.
9 k* S2 B: [6 r% F- H) i6.        Incubate tissue in 20% goat serum, 30 min, (blocking of unspecific antigens).
" T9 w* O7 K0 O% {3 b+ h6 B7.        Incubate tissue with both primary antibodies (CNPase, mouse, 1 : 100; GFAP, rabbit, 1 : 1000), 1 h.
) C* Y1 T+ P. a; N2 C; [8.        Rinse tissue with PBS, 3×3 min.) W8 v6 y8 S: o
9.        Incubate tissue with both secondary antibodies (goat anti-rabbit Cy2, 1 : 200, goat anti-mouse Cy3, 1 : 200), 1 h, RT.' J4 q6 ]5 k0 e7 q( i) c. M/ ~
10.        Rinse tissue with PBS, 3×3 min.
* r% l$ \# b7 F# s6 _* x11.        Incubate cells with bisbenzimide solution, 10 min, RT.
- n, ]3 R/ S  I0 c9 u$ _12.        Rinse tissue with PBS, 3×3 min.9 Z7 C- \  k: ^$ P3 J$ k( K" O
13.        Rinse tissue with distilled water, 1×5 min., W1 S  n& X( n3 U+ E  ?
14.        Mount slide with Roti ®-Histokitt II mounting medium.1 {5 ?! X+ @( Z

yeshch

回复 jieniao1 的帖子+ a$ T0 F, n, e

, @2 W% E0 R8 o7 r$ M' Q0 a6 r" pthanks a lot!i will make an attempt.

yeshch

回复 moluxingke 的帖子) m( \1 b3 ^" b4 j8 p; x: Q

8 @5 Y( |( S% x; N! q切片的时候，切出来的蜡条褶皱很严重，而且经常展不开是怎么回事？还有就是材料很容易就跟周围的蜡分离，甚至材料在展片后总是有空洞。还望多指教!

moluxingke

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蜡片起皱一个原因是刀片钝化。建议及时更换新刀片，另外，有时候全新的刀片也会出现类似现象，这个时候需要将蜡块在冰上预冷一下，然后切片。时不时的用口对着蜡块哈气，这样切出来的片子就没有那么皱，展片时，在载玻片上滴加几滴70%酒精，然后将切好的切片放上去，再转到水槽里面，利用酒精张力，利于展片。展片水温可以适当提高一些。* V4 `' P3 u: Y
关于第二个问题，主要是你包埋的时候组织过冷，和周围的蜡没有很好的融合，所以包埋要快，在没有包埋之前，组织最好浸在融化的石蜡里面。 意见仅供参考，也可能还有其他原因，逐个排除吧。

yeshch

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; j* q- ]% l2 Z" F; N; Z4 T" B: W/ v1 @  E+ j8 y% B& y
非常感谢你的指导，我再试试看