求助，有做过羊膜上皮细胞的大神吗？求帮忙

听不到

我是取得羊膜之后，分为两半，对之用PBS（双抗）进行洗涤，然后用0.05%的胰酶-EDTA消化20min（37°水浴），共消化了2次，终止后用250目筛，然后离心重悬，当时取得的细胞挺多的，种于两个10cm平皿中，但是48h后我换液后发现贴壁细胞非常少，而且形态各异，想请问下大家大概哪种细胞是羊膜上皮细胞啊？还有我操作的有哪里不对导致细胞量这么少呢?# w5 S( w! m: l9 G" }: ^; I- v
这是我种了两天之后的细胞（换液前)) i7 A5 O: M$ o/ f+ ]# b8 v4 }1 {6 R% j

2014-11-21 15:36 上传

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" m0 f8 b3 {  p8 u这是种了4天之后的细胞
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frankhu

根据图片看，这次试验可以宣告失败了，羊膜上皮细胞应该成铺路石状，而且为了得到更好的纯度，一般接种密度尽量大，一般24小时贴满效果比较好。

听不到

回复 frankhu 的帖子3 l* B! x6 V4 v3 v: u; T" L. z

! x# T3 r& X5 q4 W! I那我操作的步骤是哪里不对吗？我初步想的是可能是我拿到之后去血去的不干净，但是我只是在PBS里洗的话洗不下去，然后我用镊子打算捏下来的时候就感觉是撕下了一层膜，我就不敢撕了。其次就是我消化的次数太少，我消化了2次，打算再做的话消化4次，不知道这样改进行不行。但是去血这边我还是不太确定

frankhu

你先保证羊膜是新鲜的，方法有好多种，图片上看效果很不理想，感觉消化下来的都是死细胞

听不到

回复 frankhu 的帖子
: z- b9 p2 @. e: T& ?2 M
+ X" ?2 ^) w+ ?0 J, _4 d羊膜算是新鲜的吧，我是从医院拿到后约1h放入4°的，然后又过了2h后开始做的，那是我在用PBS洗的时候应该再彻底些吗？我实在不知道应该咋整了...

frankhu

再做几次试试，羊膜上皮细胞本身就不好分离

听不到

回复 frankhu 的帖子
  ?. v; e4 v" a! a! g
: M; U6 R6 y. x  p* i8 Y羊膜不好整啊，不咋敢试，那你看我图中有像羊膜上皮细胞的吗？我老觉得有间充质呢

yaoguanping

那些都不是羊膜上皮细胞，实验需要重做，具体是你的上皮都没有消化下来，上皮应该是铺路石状。

听不到

回复 yaoguanping 的帖子8 ]2 V1 H9 C* b+ l, n0 ^

; q" {' v( |/ i那是由于我最初没把上面的血清下来的原因吗？我消化了挺长时间的啊，怎么会没消化下来呢

frankhu

回复 听不到 的帖子
3 I, g! [. C1 R5 M# M2 O! P3 `: x6 z8 \7 O5 ]9 @0 H: L- F
羊膜一定要充分洗净，你可以试着放到摇床里孵育消化，消化后再过筛。