求助：关于细胞转染

yinchong42

由于实验要求，需要把一个22kb的质粒转入3T3细胞，由于质粒较大，我决定使用电转，由于质粒自带GFP，因此可以直接通过荧光显微镜检测转染率，
- J# ?2 E# T* `9 }9 K& H' G结果发现镜下的细胞没有荧光，而培养基内的一些类似杂质和死细胞的东西有荧光，请问这是怎么回事？
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3 l1 z3 K5 g: y' mPS:我是使用的英俊公司的电转系统，一般转染后要求使用无双抗培养基，但我使用了普通培养基，不知是否是因为这个原因？
5 I4 Q+ O7 \; b3 b& C还有就是一般电转会要求质粒浓度很高，但是一般的试剂盒提质粒浓度很难达到这个要求，请问该如何解决这个问题？

mecol

要事先浓缩病毒的，不然效率很低。应该用无双抗培养基，目前查的也都是这样的。

yuanyecat

回复 mecol 的帖子* g8 |: v$ T4 h
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他不是用的病毒包装，用的是穿梭制粒。

yuanyecat

楼主你的片段很大的，用质粒是很难成功的，我推荐你用病毒包装系统。我实验室之前使用的Life tech公司的病毒包转系统，效果很不错。

mecol

回复 yuanyecat 的帖子+ m! X. U4 m. ^1 a5 _; @" Z
0 U4 Y, w3 d* y6 D. f5 I# m
能否推荐一下，谢谢！

apsuifeng

回复 yuanyecat 的帖子8 g. B! d3 z- H- N  `1 E8 S

) t8 h, S/ w% t) t% @这么长的质粒，病毒包装是很难的吧。坦白讲楼主的质粒的确很大，不过也不是不可能。对于大质粒转染，由于质粒很长，对应的拷贝数就会变少，直观的影响就是转染效率低，不过转染时首先保证质粒纯度，其次适当的提高一些浓度，还是可以实现的。

apsuifeng

坦白讲楼主的质粒的确很大，不过也不是不可能。对于大质粒转染，由于质粒很长，对应的拷贝数就会变少，直观的影响就是转染效率低，不过转染时首先保证质粒纯度，其次适当的提高一些浓度，还是可以实现的。楼主看到的现象，应该是杂质的自发荧光，这个不能说明什么问题吧。8 U$ b! ?+ ^3 \/ p- @

daviddow

我觉得不是质粒大的问题。你试试小的质粒是不是有这个问题？如果没有，说明 你转染体系有问题