鸡精原干细胞的免疫组化染色（培养板中染色）

梦茹

免疫组化染色（培养板中染色）+ J# N9 t: v1 R7 X
1 培养的干细胞集落，弃去培养基，冷的PBS洗两次，首先用4%多聚甲醛（4孔板200μl）固定10min，PBS洗2次，每次5－10分钟。6 ?# j3 Y7 G2 ~; n+ I1 e  I
2 在含0.1% Triton X-100（4孔板200μl）的PBS中进行10min的透膜处理，PBS洗2次，每次5-10分钟。手动轻轻晃动数次，吸尽液体。
% |7 z" r$ H- W, b3羊血清用PBS配制成4％羊血清封闭液，室温封闭（4孔板200μl）30分钟。, ?+ A% C7 d: q3 s, w
4用封闭液稀释一抗到工作浓度（1：20），去封闭液，勿洗，添加一抗（4孔板50μl），于37℃条件下孵育1h或放在4℃冰箱过夜，PBS洗3次，每次5-10分钟。（同时设一孔不添加一抗作对照）
3 K$ r, m2 O% o6 C" [" p5去掉一抗后，细胞用PBS洗三次。同时用PBS稀释二抗（1：200），然后加入相对应的孔（4孔板200μl），在室温条件下作用30-60min。PBS洗3次，每次5-10分钟，最后留少量PBS。同时采用不添加一抗，而仅添加二抗的细胞作为阴性对照组，检测二抗的非特异性结合能力。
9 M& C0 Y# E% I. X# E6免疫标记过的细胞通过荧光显微镜进行检测拍照。1 {1 ]& q3 p# V+ a- G" v
2 m. U: o7 b9 o% Y: I
（可最后添加10μg/ml的PI染细胞核5分钟，PBS洗2次）
& \. |6 A! Q1 E& {SSEA-1, TRA-1-60，TRA-1-81为IgM ；SSEA-4为IgG，注意添加相应二抗
% W  G6 i8 Q! h0 c& j
0 a- X6 C+ Y' X$ K2 j所需溶液：8 r  b$ h1 j$ i! y; l
4%多聚甲醛、0.1% Triton X-100/PBS、4％羊血清封闭液/ PBS
8 W2 g$ b. B$ V% {+ ]
6 v7 ]' W8 [: q, C) m1 P问题向导 ： 9 Z! B6 G# P2 x( e! m
•  染色过深： ) b, X! B; d+ _6 h( T& j8 A
⑴ 一抗浓度过高或孵育时间太长； ⑵ 孵育温度过高。& l- ]6 q- I: `) I
•  非特异性背景着色：0 R. t$ [8 z7 J5 s+ W# r1 t9 j
⑴ 缓冲液冲洗不充分； ⑵ 操作过程中组织切片干片； ⑶ 操作过程中组织发生折叠；2 j& x# k5 A4 R* ^9 L/ j& X
⑷ 组织中包含内源性的过氧化物酶； ⑸ 抗原扩散； ⑹ 多余的组织粘附在组织切片上； ⑺ 蛋白阻断剂阻断不充分。
" O, n9 P$ Y" G" [# O' |•  染色过浅 ：% d$ b7 [$ {- N6 V
⑴ 一抗浓度太低或孵育时间太短； ⑵ 试剂已经降解； ⑶ 操作过程中缓冲液冲洗后残留过多，导致试剂被稀释； ⑷ 复染或封片剂不相配，色素反应产物被溶解；