【跪求流式大神】分选的流式图总是shift

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* x5 ^3 D- Z1 o0 V. D+ w先说一下我实验的一些情况，我要从组织中分选一类细胞，两个表面抗原，一个正筛一个负筛。用的都是间标的抗体，杂一二抗。) u: S5 Y% i% [6 v
A抗体来源于大鼠，连着生物素的单抗，用Alexa Fluor 488标记的链霉素作为二抗；6 D+ T- ]; H& \. K( @
B抗体为兔多抗，我用donkey anti-rabbit Alexa Fluor 555作为二抗。: w# s9 j0 u; _
学校的流式分选仪器是BD的AriaII，有358nm, 488nm, 633nm三种激发光，因此我这两个抗体只能选择488来激发。
" K0 s8 ^" P1 A+ K; Y0 [* ~! l# h7 F+ Y2 h# Z1 w
实验的步骤大概是这样子：组织经胰酶+DNase消化，过滤得到单细胞悬液，镜检、计数。调整细胞浓度到1*10^7cells/ml，加入抗体。冰上同时孵育两个一抗一小时，洗两次，敷二抗半小时，洗两次，上流式前5min加入Hoechst33342，以便在区分掉死细胞。& k! R' y4 l! [& M* E

& `( J) [; L4 @9 g以下是几次重复的结果：
) k; q) h) P7 {

2015-3-9 10:57 上传

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1 v; y$ t0 h: n& Q+ `8 j, S9 f4 p/ }! T首先是control组，不知道上头那坨东西是什么细胞（肯定不是死细胞，而且我抗体也不会加错），几次重复都或多或少有这么一群东西；$ b& q/ U) m9 i: ], `
其次，FITC通道勉强能有一群细胞出来，但是整个population，包括nagetive cells，都往右偏；
7 S9 `/ l' }# W$ F8 o' m3 `, K而PE通道则整个群往上走，导致我没法分出细胞群。
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2015-3-9 10:57 上传

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! g1 O, u- _7 m这次结果好很多了，单独PE通道能分出群，但是一旦加入A抗体，则整个群依然往右shift。我这里要强调的是，基本上这个领域内所有的文献都报道这两个抗原属于两种细胞，而且我自己IF的结果也显示两种荧光并不merge，所以这里理论上不存在说细胞同时表达两种抗原的可能。, y' T! `# u3 C
但是呢，加入A抗体后，基本所有的细胞都会往右shift，所以将PE阳性的细胞带出我用control框出来的门P4。我个人觉得这里应该不能用补偿把细胞往左调吧？
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2015-3-9 10:57 上传

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+ S3 ~/ n2 G) ?* b
我重复了一次，和第二次的结果一样，细胞都是往右偏。: I1 v/ B& X# H  T( Z6 s6 B
' G2 K+ E- X" C2 ?( ~
一开始怀疑A抗体浓度过高或者孵育时间太久，但是减少浓度或者时间并没能改善结果。
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8 b" T$ z7 L! H9 ?% z! `1 O不知道有没有大神能帮忙解惑，不胜感激！

mantianfeiyun

1. 重做荧光补偿
1 g) v, P3 u- c) t& A6 V1 L/ c
3 w) L- L6 D+ ~* f2 q2 H2. 洗涤流式细胞仪液路系统1 K9 T! c! |2 K6 h7 b  ~
  y; H1 p, W, Z1 n( ]3 B" f8 z) V8 }
个人建议，不一定对。

w343989328

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. P( o0 {6 n" ~8 C9 `- }7 y# E0 L
  r; r3 x5 e# w- c! O9 H; w上面的图都是没有设置补偿的。, W7 O5 l# {6 K- {4 z
有一点我不是很明白，我这样只是单个通道的shift，这样调补偿没有意义吧？

dollar007

单标，不需要补偿。
4 r4 f. D" x( O7 Z8 G" E0 j9 I5 u8 nFLOWcheck、FLOWset都做过，没问题吧？
3 _' j, n$ W0 t+ i. t' Q) N& E你检查下你的数据采集时间，是否跟你的上样浓度符合——比如上样量为80-100万个细胞，体积300-500ul，那么数据采集速度大致在500-700个/秒，搜集1万个数据也就10来秒的时间。如果采集时间为30-40秒，那就是有很多数据都被仪器当噪音屏蔽了，说白点就是FS阈值设定高了，你当前分析的都是些肥胖细胞，所以图形shift。贝克曼的仪器一般默认是100，BD的不知道，你将它设定低点，再检测。

w343989328

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) b) @4 }& H& G. x5 `. Y* Q7 Y7 N) \+ x; q2 m' w( R
谢谢您。您说的FS阈值是指什么呢？
. Z  d% G$ [+ z: u9 i" w我用FSC SSC框下来的细胞是同一群，我不是很明白您说的肥胖细胞是指。。。

w343989328

顶一个

w343989328

求大神。。

dollar007

流式通常用FS设阈值，贝克曼的通常这个值是100，即FS=100.仪器默认FS值小于100的信号为噪音信号，不纳入分析。初设定参数时，如果不清楚此细胞的特性，我们通常把阈值由低调到高，调到什么值合适呢——调到FS/SS散点图左下角能略看到一些碎片即可。如果阈值设定过高，那么碎片群你图上看不见，同样的有部分细胞信号也被屏蔽了。我以前做CIK双阳检测的时候发现的这个问题，上样量与检测速度不匹配，后来发现是这个问题，阈值采用机器默认的FS=100，在当时的电压下，80-90%的细胞都被漏检了（被仪器屏蔽了，认为是噪音。）当我把FS调整为50的时候，这部分数据才得以在图上显现出来。“肥胖”细胞是我做MSC时爱用的口语，通常MSC“干性”好时，细胞很幼稚、细小，表现为FS和SS值都很小，而一旦MSC成熟或者衰老时，细胞会变得很扁平、肥大，此时FS和SS值都很高。通常而言，肥大细胞即尺寸大，内容物更复杂、丰富，表现为FS/SS值更高，更易被检测出。( N/ r& \2 v$ ~, u& ^& O( M: E
希望对你的实验有帮助。

zz091115

和机器 补偿什么的没有关系 是细胞本身的原因 你做的应该是上皮类细胞 如果是血液系统一般就不会

w343989328

回复 dollar007 的帖子) D4 J, i7 f# ], Y: q. g& r4 x0 N

+ q' g6 \1 H9 z3 h3 L谢谢你！可是我觉得这里的shift跟SSC FSC两个参数没太大关系啊。