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我们是最近开始养人得胚胎干细胞,上手也去别的实验室学习交流过,但是自己养得时候问题就出现 。9 ^+ L& } d- D4 P
1.细胞什么时候该传,很多人见解不一样,但现在大致能摸到;+ S3 ^7 z" n0 i6 x' ~' c
2.传代之后细胞肯定死一大片,液体里面全是细小的细胞碎片,甚至传完镜下观察还感觉不错的细胞,第二天也没几个活的,就算活着也是状态差的;
o. q: x& C7 Y3.冻存后再复苏,几乎复苏不起来。。。。
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+ O4 R0 C) @: I+ e我们的传代方法:
4 l+ }, T V3 ^1 s6 m: S7 o培养液:E8;
" b6 B9 {, Y* L3 ~( T+ }/ v' }提前一天铺metrigel2 N! g# |* }) g( w. k' b, z, Z, c
1.弃液,DF12洗一遍; T" @% A) T# c; V. p
2.加1:1000稀释的0.5M EDTA消化4min左右,镜下观察细胞间隙变亮,吸掉EDTA加入培养液终止,小心吹散细胞块;(此处存疑:有些克隆贴在壁上,需要用力吹下来吗,吹不下来能用枪头直接刮吗?)6 I! \# `7 ^! @1 Q
3.离心800rpm 3min,接种(关于传代比例也有问题,有人1:20左右传,有人1:5左右,这个概念太模糊了。。。)
: H8 ]5 c& v+ }5 q* \) }$ g4.因为之前听说离心对细胞有影响,所以最近都没有离心,直接按比例接到新皿,活细胞是多了点,但状态依旧没有传代前好。' f8 o' t5 ]% O7 e& g
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求大神指教~ |
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