新手养人胚胎干细胞，问题多多，求大神们解答~

XIE冬D

我们是最近开始养人得胚胎干细胞，上手也去别的实验室学习交流过，但是自己养得时候问题就出现 。; k* W  D% B: ?7 w! ^
1.细胞什么时候该传，很多人见解不一样，但现在大致能摸到；
3 W. a! D1 `2 r( Z( G9 y2.传代之后细胞肯定死一大片，液体里面全是细小的细胞碎片，甚至传完镜下观察还感觉不错的细胞，第二天也没几个活的，就算活着也是状态差的；
9 k; t- d2 p+ a0 f, w3.冻存后再复苏，几乎复苏不起来。。。。) B! G- V" x% Z/ M# p' B
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我们的传代方法：# w- G0 c1 b4 w4 w
培养液:E8；
0 p/ A1 b2 a: I. Y5 }提前一天铺metrigel# W1 d& S4 [2 l, X
1.弃液，DF12洗一遍；; b' p4 [  R; v5 U
2.加1:1000稀释的0.5M EDTA消化4min左右，镜下观察细胞间隙变亮，吸掉EDTA加入培养液终止，小心吹散细胞块；（此处存疑：有些克隆贴在壁上，需要用力吹下来吗，吹不下来能用枪头直接刮吗？）
6 |, e! c( T/ b/ @$ s3.离心800rpm 3min，接种（关于传代比例也有问题，有人1：20左右传，有人1：5左右，这个概念太模糊了。。。）; V! t( W# w0 ^3 b$ Y! J( l2 W
4.因为之前听说离心对细胞有影响，所以最近都没有离心，直接按比例接到新皿，活细胞是多了点，但状态依旧没有传代前好。, ]( R3 A+ P9 H+ ?9 b9 |  Y

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求大神指教~

XIE冬D

补充一个问题：培养箱CO2浓度会影响细胞吗？最近新换气瓶，不稳定，老是降到0.1，有一批细胞就经常死。。。想找出细胞死亡的原因，因为传代之前还不错，接种之后感觉还挺有活力的。

刘森泉

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; x' Y! _+ q, A7 I, Z: V) a
; `/ D' V. c& ]3 h$ r" j0 G. f不用提前一天铺metrigel，提前一个小时就行。0.5mMEDTA消化8-12分钟（E8说明书也是这么推荐的呀），看克隆大小而定，基本要消化到每个细胞都间离，这样不会有吹不下来的细胞。去除EDTA，离心不离心没关系，1:3-5传代。最好加点Y-27。这样基本没有死细胞，100%存活。

XIE冬D

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8 w5 Y" o+ x+ N3 N& n! |6 _( `# t# ^9 ~$ V. [; c9 z
嗯，好的，我调整一下铺基质的时间跟消化时间，还想请问一下，CO2浓度对人胚胎干细胞影响大吗？我们实验室有好几次细胞死掉正好那几次培养箱CO2降到0.1。。。。

刘森泉

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- R* Q6 E. `$ z- c( I$ [" }CO2长时间低的话肯定对细胞有影响咯，如果一段时间，比如一个晚上，基本没关系。

woshizh

1.matrigel  铺半小时以上就能使用8 \6 Y" w7 V1 \/ C" G
2.用E8养的hESC  理论上EDTA可以消化后直接传代，不需要离心，James的实验室是这样传的，但身边很少有人能用EDTA很好的传代) _  B- G/ I$ p6 ~3 W% D
  一般还是用dispase或胶原酶IV 消化3min左右见细胞边缘卷边亮起，弃酶，换基础液轻吹一次再用枪头把细胞刮下来
5 ^( u: d4 P" T3.离心800rpm 3min 弃上清  然后E8重悬，重悬的时候 轻吹，吹一两次散开了就行，一般不超过4次

ebio-one

个人觉得E8培养基是不稳定的，尤其是二氧化碳浓度不稳定的情况下，E8只是hES或者hiPS培养必须添加的8种成分组成，对外部条件要求比较高，也就是说对环境比较敏感

Jiangshi90

XIE冬D 发表于 2015-5-4 10:49
7 ]4 T* E$ a9 F& ^! g3 u6 x3 n6 c我们是最近开始养人得胚胎干细胞，上手也去别的实验室学习交流过，但是自己养得时候问题就出现 。- Y0 o: v3 W% [  Q( R
1.细胞什 ...

) i  ?! m8 K3 W) @+ H6 M4 z; w
细胞汇合度达到80%以上就可以传代了
' \4 J8 W; ^! P. n* ?7 Y0 @$ v传代时采用EDTA消化，有些克隆贴在壁上吹不下来的话，说明消化时间不够长，用适度的力度仍然吹不下来的话就直接舍弃吧，不然吹下来也活不了8 L7 Z+ `) O* u0 u- {0 z( j, \3 z
传代的话没有必要离心，吹走EDTA后，用培养基把细胞吹下来后直接接种即可5 ]1 d1 n- N/ B* S0 K
冻存后再复苏对细胞伤害很大，因此一是慢冻速融，二是细胞数量要足够多，三是细胞状态要好。

MyGirl

消化时间上太短，宁可稍微过消化也不要去用枪头去刮造成不可逆的物理损伤，E8体系我们用的是 VTN 胶，包被一个小时，但是最近养着容易暴毙，换液后就全部漂了，在找原因中。建议接种的时候计数保证接种活率，现在我们的接种活率大概在约97%，如果死细胞太多对微环境还是有很大影响，建议低速离心去除死细胞在接种

漂流瓶

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1 K1 _7 k( V8 t& ~4 c请问低速离心大概是用多少，我试过700rpm/5min, 效果也不是很好。基本消化后传代的细胞都不会再贴壁，而是满满死掉了。包被试过matrigel, PDL, collagen都没有什么显著效果，担心是培养液问题，全部都重新配了，可是还是不行。最近很是发愁，希望大家能给出出主意。