新手养人胚胎干细胞，问题多多，求大神们解答~

XIE冬D

我们是最近开始养人得胚胎干细胞，上手也去别的实验室学习交流过，但是自己养得时候问题就出现 。# m* R/ }2 ]1 d  }
1.细胞什么时候该传，很多人见解不一样，但现在大致能摸到；: }4 D: b6 g, X% w$ W" [. W
2.传代之后细胞肯定死一大片，液体里面全是细小的细胞碎片，甚至传完镜下观察还感觉不错的细胞，第二天也没几个活的，就算活着也是状态差的；
! R8 P' Z2 n& h# c! }3.冻存后再复苏，几乎复苏不起来。。。。. t, V, O6 r; C& ]- O
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我们的传代方法：: u$ E# X! |& X9 Y' V6 Z, T& B
培养液:E8；! n6 \( z& C4 x
提前一天铺metrigel
% x) s+ \. r9 T! O4 O" I1.弃液，DF12洗一遍；2 Z0 Y/ a7 n0 W# @& Q0 r2 [' l
2.加1:1000稀释的0.5M EDTA消化4min左右，镜下观察细胞间隙变亮，吸掉EDTA加入培养液终止，小心吹散细胞块；（此处存疑：有些克隆贴在壁上，需要用力吹下来吗，吹不下来能用枪头直接刮吗？）
2 j, b  M  i5 X/ W8 S' G  f% u3.离心800rpm 3min，接种（关于传代比例也有问题，有人1：20左右传，有人1：5左右，这个概念太模糊了。。。）; J7 G, @' d, i. N
4.因为之前听说离心对细胞有影响，所以最近都没有离心，直接按比例接到新皿，活细胞是多了点，但状态依旧没有传代前好。
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9 P. Z2 q# a" \% I  q- ~求大神指教~

XIE冬D

补充一个问题：培养箱CO2浓度会影响细胞吗？最近新换气瓶，不稳定，老是降到0.1，有一批细胞就经常死。。。想找出细胞死亡的原因，因为传代之前还不错，接种之后感觉还挺有活力的。

刘森泉

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不用提前一天铺metrigel，提前一个小时就行。0.5mMEDTA消化8-12分钟（E8说明书也是这么推荐的呀），看克隆大小而定，基本要消化到每个细胞都间离，这样不会有吹不下来的细胞。去除EDTA，离心不离心没关系，1:3-5传代。最好加点Y-27。这样基本没有死细胞，100%存活。

XIE冬D

回复 刘森泉 的帖子$ q5 D2 ?, ]( |6 P
. e" j, v: x. L- J( ~
嗯，好的，我调整一下铺基质的时间跟消化时间，还想请问一下，CO2浓度对人胚胎干细胞影响大吗？我们实验室有好几次细胞死掉正好那几次培养箱CO2降到0.1。。。。

刘森泉

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CO2长时间低的话肯定对细胞有影响咯，如果一段时间，比如一个晚上，基本没关系。

woshizh

1.matrigel  铺半小时以上就能使用8 t+ c; l: m) l% J2 X
2.用E8养的hESC  理论上EDTA可以消化后直接传代，不需要离心，James的实验室是这样传的，但身边很少有人能用EDTA很好的传代; P2 N0 y) G- B& l! y2 B# b
  一般还是用dispase或胶原酶IV 消化3min左右见细胞边缘卷边亮起，弃酶，换基础液轻吹一次再用枪头把细胞刮下来- R1 a0 }! z% j! g6 I6 a- @9 l
3.离心800rpm 3min 弃上清  然后E8重悬，重悬的时候 轻吹，吹一两次散开了就行，一般不超过4次

ebio-one

个人觉得E8培养基是不稳定的，尤其是二氧化碳浓度不稳定的情况下，E8只是hES或者hiPS培养必须添加的8种成分组成，对外部条件要求比较高，也就是说对环境比较敏感

Jiangshi90

XIE冬D 发表于 2015-5-4 10:49 ( `# R0 X9 V4 l' K
我们是最近开始养人得胚胎干细胞，上手也去别的实验室学习交流过，但是自己养得时候问题就出现 。
$ E( Q# F( h; l$ L" ^* f9 |1 D  M1.细胞什 ...

- H1 ?8 c3 b. H# v
细胞汇合度达到80%以上就可以传代了
$ ]( L- _( u5 F  l$ F4 ~( T: Q0 e6 ]3 k传代时采用EDTA消化，有些克隆贴在壁上吹不下来的话，说明消化时间不够长，用适度的力度仍然吹不下来的话就直接舍弃吧，不然吹下来也活不了
* s2 f0 }4 I% k' \传代的话没有必要离心，吹走EDTA后，用培养基把细胞吹下来后直接接种即可# b0 K$ D  v, L" k. B, S1 |5 o
冻存后再复苏对细胞伤害很大，因此一是慢冻速融，二是细胞数量要足够多，三是细胞状态要好。

MyGirl

消化时间上太短，宁可稍微过消化也不要去用枪头去刮造成不可逆的物理损伤，E8体系我们用的是 VTN 胶，包被一个小时，但是最近养着容易暴毙，换液后就全部漂了，在找原因中。建议接种的时候计数保证接种活率，现在我们的接种活率大概在约97%，如果死细胞太多对微环境还是有很大影响，建议低速离心去除死细胞在接种

漂流瓶

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( d: U1 R$ y9 W0 o% v) @0 b1 W1 l/ m* p, r# f% U' e; H1 [
请问低速离心大概是用多少，我试过700rpm/5min, 效果也不是很好。基本消化后传代的细胞都不会再贴壁，而是满满死掉了。包被试过matrigel, PDL, collagen都没有什么显著效果，担心是培养液问题，全部都重新配了，可是还是不行。最近很是发愁，希望大家能给出出主意。