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本帖最后由 细胞海洋 于 2015-12-22 12:26 编辑 * x" ^# j+ w8 V8 S* r' n# @
8 ]( U: l2 @/ q% Y) V3 A
有一个相关的，希望对你有帮助
# X- R K. {- L# v/ ^一、目的
, v; w% U2 t" Z% P7 k, _7 b7 w I1 J6 U" M: }$ f
MDCK细胞培养是分离流感病毒及相关研究实验的基本技术。疾控中心的所有技术人员，必须按照本文件相关的操作规程进行操作。
( S, x/ i) J' q/ W! k
9 `4 I! t( T% z4 F二、适用范围
2 ~6 J5 V1 r; Z
5 r) i2 k/ U: x) n5 g适用于疾控中心所有技术人员 。, A+ \, R$ W1 Z: f+ d4 p
7 _% t/ W- J' o2 A, r
三、程序5 J+ g5 C/ O% `, o% Y2 b3 j) ]( O8 Q
" D7 S' q- [3 E# C% [（一）生物安全要求9 D3 _; u6 e1 H) `4 E& m: q
$ U! t) s/ q1 p7 f5 v实验室生物安全级别：BSL-1) e3 f8 a8 o, i: a9 L
/ v. C; ~) F& a9 ]所有操作必须在BSL-1实验室的生物安全柜里进行。; F' G5 j9 c3 z* Q w9 ]
3 n s9 _/ y; W+ e
（二）材料. m. k. u9 I6 M' {9 F- F" I3 G
% ~5 ~: P: @$ ?. ]* R( S8 W
1. 生长成片的MDCK细胞
6 p/ x% F. s7 I1 }
8 a/ N" ]; M) H( J# y% k/ I2. 无菌的T25细胞培养瓶
) G) n3 k$ Q4 ]- \$ _- A) M0 Z, S6 r g5 l
3. D-MEM培养液（含有L-谷氨酰胺）+ s# z% l& V3 e0 ?, F0 v. Y
( o5 Q" U% d/ |8 m6 g$ w6 j
4. 青、链霉素母液（10000 U/mL青霉素G；10000µg/mL硫酸链霉素），分装后保存于-20℃
6 D- v" y% b; U2 g* D- B
2 w3 t+ D7 [1 f8 @5 b: ]' y3 o3 _0 \, A5. HEPES缓冲液，1M母液1 l; S6 O9 u4 T! O3 u1 n
6 @" [7 O) C& x$ A9 W, e- ]5 S2 e. A6. 胎牛血清
2 ~5 A. L' I# |1 B( E9 D
" R: C0 b% @. r/ Y1 M* O0 k1 ^7. EDTA-胰酶（0.05%胰酶，0.53mM EDTA-4Na），分装后保存于-20℃
5 W8 R9 h. d' g" U/ D0 l) q4 C' l$ Y; M
8. 7.5%牛血清白蛋白组分V
, g. `. P- E( C9 {4 | J. ]" |5 Y" o- ]8 T& N
9. 1mL、10mL无菌移液管
p: n3 W' e: m0 Y( q4 m2 w* b5 l f" l/ v' V' [6 ~8 Z
10. 70％～75％的酒精7 y6 J2 E7 F, T( Q9 z- B. ?6 M
& T$ h5 F/ x0 I: q
注意事项：经常检查试剂使用的有效期。. c1 ^+ E0 u: O* J- P5 c4 ~1 ^$ B
- S# g/ f2 X0 h0 u5 F（三）实验步骤
U Y; |" R; I
$ \- b: c& w; o这里以T75细胞瓶的单层细胞培养为例，叙述MDCK细胞的培养程序。如果细胞瓶的规格有变，MDCK细胞悬液的量必须做相应的调整。
& A# d' t$ Q5 x9 A9 l1 {; \# r: k6 u
1. D-MEM培养液的准备7 f" C4 @2 h7 s% r+ T& L; j4 q
% h- ]* |: q( V500mL D-MEM液中加入：, Z% J. e* s8 l9 }+ @; C4 J& {5 I
9 K/ P4 Z& @4 ^青、链霉素母液5mL（终浓度达：100U/mL青霉素；100µg/mL链霉素），" c0 z+ W9 h/ ]' t
6 V% y4 |% C$ \; {& h/ g" i JHEPES缓冲液12.5mL（终浓度：25mM）。
1 Z" B3 I X1 x6 d- Y9 Q( r
: ?, k5 ^% `% \8 c! _5 D! |9 T+ g$ s7.5%牛血清白蛋白组分Ⅴ 12.5mL
/ R& {% ~$ f; Y* O4 k
8 J# ^! x$ n2 J0 N/ H+ {% ~7 P2. 细胞生长液的准备- y( }& a6 T- M$ G8 h! Y- I" w
& C- l' k8 {5 D0 j" [% V' q8 Q胎牛血清10mL加到90mL的上述（1）的液体中，使胎牛血清的终浓度为10%。( y8 i5 _" f `$ l" u3 Z
2 p h. @7 `. ?4 o) K! c; m3. 首先将细胞培养瓶中的培养液弃去，加入5mL在37℃水浴中预热的EDTA-胰酶。
& W }! ]% L0 ~7 a- q7 y& e3 X; S( J/ ]4 X. J
4. 温和地摇动细胞瓶1min，使EDTA-胰酶均匀分布在整个细胞薄层。然后用移液管吸去EDTA胰酶。/ ]/ I/ ?, N0 b4 W0 W# c0 I
# S2 C" W, |% a* D2 \- x2 X8 ]5. 重新加入5mL在37℃水浴中预热的EDTA-胰酶重复上述步骤。
% X4 P& q# w+ v
* {( f* x/ \5 d& U/ n7 U6. 加入1mLEDTA-胰酶使其均匀分布在整个细胞薄层，37℃孵育细胞瓶直至细胞从塑料细胞瓶的表面分离（约5～10min）。必要时可以摇动或吹打来分离细胞。然后加入1mL胎牛血清灭活残余的胰酶。
2 j! q: a: G* a& a& ]1 w% |' N
6 Q1 m# `. l1 Y n& _; x' V7. 加9mL已经配置好的含有L-谷氨酸的D-MEM培养液，轻轻用移动移液管来吹散细胞团。
0 O: g3 z- e9 D" P/ F" T) ?$ |* i1 P" L- s z( ~# W6 C
8. 取10mL混合物加到90mL细胞生长液（细胞悬液的浓度大约为每毫升含105细胞）
* a& \. j* \1 o) }( u; I# q- I
$ j9 x- r! L8 w6 O9. 每个T25细胞培养瓶加入6mL（6×105/mL）细胞悬液，剩余的细胞悬液可以加到T75细胞瓶用于细胞传代。通常6mL细胞悬液2～3日可生长成片（80％～90％）的单层细胞。
: }5 }( D5 ^7 t" S( n
0 S/ f+ Z9 z7 e+ f8 F* y5 y10. 于37℃，5%CO2培养箱里培养细胞，每天观察细胞状态，以供进一步实验用。
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发表于 2015-12-17 08:53
