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本帖最后由 细胞海洋 于 2015-12-22 12:26 编辑 1 s& f3 p3 k% |3 c9 u- ~
1 X5 q% u8 K% h! h6 U# P$ K% C& m有一个相关的，希望对你有帮助* L' O2 r. x) w; `) _
一、目的
8 r3 ?9 |" B; K5 t+ I1 V9 I7 H8 D0 G
MDCK细胞培养是分离流感病毒及相关研究实验的基本技术。疾控中心的所有技术人员，必须按照本文件相关的操作规程进行操作。. Q* V& j+ j# D& u( b4 U* l( {
" q4 r( j+ D5 v1 A$ {3 {3 J二、适用范围$ ?) ?2 [5 N) [( X$ b3 D
4 d3 N" {# M; u. v# Z
适用于疾控中心所有技术人员 。+ M8 T! b# J9 ]2 L3 O% ^- {. z i& w& E
/ \5 a9 O9 Z" z6 i/ M
三、程序
( M, l5 o7 J9 B
) b) y% l+ q7 ]/ l3 d（一）生物安全要求
/ a3 r& F' e1 e
& A* C% K# {0 d+ b7 C实验室生物安全级别：BSL-1
Q+ e6 H3 p$ l3 N. A" P v# \4 b1 E7 H; B
所有操作必须在BSL-1实验室的生物安全柜里进行。
) n5 J5 J. p/ f
- U6 v2 [" [- R9 Y9 N5 [. a% V2 N（二）材料. B4 m* ~9 h" C: \/ }& Q1 f$ g2 \# `
4 i! K. d/ I; s( F6 |3 n1. 生长成片的MDCK细胞& O3 Q+ ^* x( ^# U1 L; Q$ E
' g. y$ N' H9 s- d: Q9 _5 z2. 无菌的T25细胞培养瓶2 N7 N- K G6 H& \) m
( }- ~5 |0 f% Q3 R
3. D-MEM培养液（含有L-谷氨酰胺）* e# G7 T# j7 z+ ?- e, t
$ n6 f' w4 Q: j% H: s5 P- |. @% K4. 青、链霉素母液（10000 U/mL青霉素G；10000µg/mL硫酸链霉素），分装后保存于-20℃
2 j0 x* Q9 K3 j
# q9 F( z& z8 H) n8 t; x( ^5. HEPES缓冲液，1M母液 Y' i* x G9 F/ a" K5 N2 S7 q
* f2 I5 S h7 U, |( k
6. 胎牛血清- @: q9 `. \' P7 o
: T3 F! G" B' K, P9 Z, E0 \5 c4 E7. EDTA-胰酶（0.05%胰酶，0.53mM EDTA-4Na），分装后保存于-20℃( l5 p" R" j$ _: q! Q
* ]' D; t/ ]- L F6 J4 ^8 x
8. 7.5%牛血清白蛋白组分V7 @, j# v( ?" \- B: h; o/ l7 B" v
9 L; |% W; h' W6 w8 o5 y+ G4 _$ ]3 w
9. 1mL、10mL无菌移液管
4 `% m" c* @/ k$ O) X' x1 z+ n; ~5 y/ d
10. 70％～75％的酒精 }/ N% N& t/ Y7 q
$ r* P. J3 i8 G; Z
注意事项：经常检查试剂使用的有效期。' O0 N3 j! A3 O9 k
7 s3 q" ~! D9 Z! H7 J0 z
（三）实验步骤
2 }! q! ]8 N- H( J: v0 \/ E+ c' J7 A; k3 _- s+ t7 S6 O' S) V$ a
这里以T75细胞瓶的单层细胞培养为例，叙述MDCK细胞的培养程序。如果细胞瓶的规格有变，MDCK细胞悬液的量必须做相应的调整。
1 v% l/ V+ j9 b+ H! b- u6 ^! t6 l7 z- R: u; r, R3 g. e
1. D-MEM培养液的准备
2 k8 M% I4 }8 `% }
, \! D3 i2 R& d: _- ?" U# j! R; _500mL D-MEM液中加入：
6 S% P( X' \" l. E2 c1 n, \8 C. G
% v5 z" o6 k; ?1 f/ D青、链霉素母液5mL（终浓度达：100U/mL青霉素；100µg/mL链霉素），% R8 e4 r2 D( S# c# I% I6 ?
! e7 h: o {+ d4 ?1 y% _
HEPES缓冲液12.5mL（终浓度：25mM）。6 a/ H4 R: t6 Y0 G
* D* U- X" h6 C8 @6 i" y7 O
7.5%牛血清白蛋白组分Ⅴ 12.5mL
+ T8 O2 s5 Q2 }+ |5 a9 W" c e
# a; R5 X4 B& Q; R" ]2. 细胞生长液的准备
5 t6 m2 A, |! D3 P+ x4 i/ Q6 f# x0 A/ U. {- @
胎牛血清10mL加到90mL的上述（1）的液体中，使胎牛血清的终浓度为10%。
$ q3 _% d6 A9 v) g4 L
, E+ h, ~* `2 ?3. 首先将细胞培养瓶中的培养液弃去，加入5mL在37℃水浴中预热的EDTA-胰酶。
* b; ~6 H ~7 N5 f0 z" ?) m& Z8 k8 ^* }3 ~" W
4. 温和地摇动细胞瓶1min，使EDTA-胰酶均匀分布在整个细胞薄层。然后用移液管吸去EDTA胰酶。2 l5 d6 j$ R" S% u* P& f* {3 E! e0 r6 ~
* L, a, E$ A }' ?. \
5. 重新加入5mL在37℃水浴中预热的EDTA-胰酶重复上述步骤。
2 _; M. q# V# |7 W J/ H
6 x H. ~. B3 e8 c6. 加入1mLEDTA-胰酶使其均匀分布在整个细胞薄层，37℃孵育细胞瓶直至细胞从塑料细胞瓶的表面分离（约5～10min）。必要时可以摇动或吹打来分离细胞。然后加入1mL胎牛血清灭活残余的胰酶。; c. t; h& x" T( o
2 B0 `0 E7 O- z' [: ^; r4 p7. 加9mL已经配置好的含有L-谷氨酸的D-MEM培养液，轻轻用移动移液管来吹散细胞团。
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8. 取10mL混合物加到90mL细胞生长液（细胞悬液的浓度大约为每毫升含105细胞）
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v# G, l/ r7 ?- k9. 每个T25细胞培养瓶加入6mL（6×105/mL）细胞悬液，剩余的细胞悬液可以加到T75细胞瓶用于细胞传代。通常6mL细胞悬液2～3日可生长成片（80％～90％）的单层细胞。4 f {' L S. ^! _/ x1 w$ k+ b1 L
+ s% q& B7 R8 v1 I3 h4 k3 P1 G10. 于37℃，5%CO2培养箱里培养细胞，每天观察细胞状态，以供进一步实验用。0 Q/ K9 V# M1 e3 ?( R8 b& j8 g/ B
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发表于 2015-12-17 08:53
发表于 2015-12-24 11:29
