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本帖最后由 细胞海洋 于 2015-12-22 12:26 编辑
7 S" p2 H2 L) x/ A1 a! F
% Z+ W7 Q0 M. @- z有一个相关的，希望对你有帮助
3 x: \+ A5 z: c- [+ _- ~一、目的
9 t4 y3 Y! G i, @7 _
8 A/ o/ ?# N4 L" T# m+ LMDCK细胞培养是分离流感病毒及相关研究实验的基本技术。疾控中心的所有技术人员，必须按照本文件相关的操作规程进行操作。
1 _* D. E* W( n( u" c% C; M* e8 [3 ^: a: _ X+ F" ?' s
二、适用范围
# D5 q* W2 L: ]7 ]+ { ^% e# }
. Q+ {4 C) K4 S适用于疾控中心所有技术人员 。+ o* N3 J( b, t' E# C" ^1 G
7 @* k* i* y, |+ L3 I! Y3 r; c三、程序9 T7 Y$ E' W: i- l3 m
# D/ u- F7 Y5 X9 W( u% x1 {# G* l4 i2 q（一）生物安全要求- r' Z9 n5 e1 K
) q, ]! _6 ?3 j3 A8 x$ \' M
实验室生物安全级别：BSL-1
, y: ^" n, p# [; }' {1 w) x0 v1 \/ s, Q0 n( u4 k( e6 Y
所有操作必须在BSL-1实验室的生物安全柜里进行。( |0 L! u+ X) Y; o2 |" k
6 i+ @. l$ U+ w( R1 o, T+ ?
（二）材料* P. u0 p, M3 {) e$ z8 I/ @3 i: e- U
8 l6 `3 h+ O3 V, P- `: o
1. 生长成片的MDCK细胞
' S" |. K& w/ l& [8 c! P% q$ u' R6 P9 O/ g
2. 无菌的T25细胞培养瓶
6 `5 X" C! G3 r |
) g* Q- p( i% ~3. D-MEM培养液（含有L-谷氨酰胺）
! Y$ J$ \8 }# w% l, m) A) _6 B4 e. q; W+ t v
4. 青、链霉素母液（10000 U/mL青霉素G；10000µg/mL硫酸链霉素），分装后保存于-20℃2 o+ p- {# }) E$ Z$ @' a5 V4 ~
; T- \7 A B. W: m5 ^/ P# }9 c5. HEPES缓冲液，1M母液
. {6 q4 H& d4 l6 ] h( c9 @0 i* c# M" n- m# X
6. 胎牛血清
' T: {4 C* r, l' p0 X/ R( t* I/ a/ L( Z
7. EDTA-胰酶（0.05%胰酶，0.53mM EDTA-4Na），分装后保存于-20℃0 [! ~7 P S T6 ]2 s/ c/ G
: p% I. w9 ^3 h: }& X
8. 7.5%牛血清白蛋白组分V
, t+ c/ j8 P3 C1 y @
7 X; q6 s9 [3 a5 [6 ` ]9. 1mL、10mL无菌移液管
& D5 v$ P1 j: G2 Q5 V/ C s6 @* B& V- O( h: ^* \& q! f h, H
10. 70％～75％的酒精% _* A7 {- z2 E d( [. v* Y2 U8 J
7 Y/ V; C. p$ ?8 _/ f注意事项：经常检查试剂使用的有效期。& b1 ]+ l% S$ R) s2 X
+ j3 N3 J9 V( x8 c: q! z（三）实验步骤8 Z/ C0 m- f( L
2 ]* Y9 {* I5 d! P, X! {这里以T75细胞瓶的单层细胞培养为例，叙述MDCK细胞的培养程序。如果细胞瓶的规格有变，MDCK细胞悬液的量必须做相应的调整。$ c1 \( I, U8 Z% e( D3 a% V
1 {# u4 I! p1 c+ n: ^
1. D-MEM培养液的准备' r+ a" ?% Y6 @4 P% C
3 P7 C+ u+ Q1 s. q( A
500mL D-MEM液中加入：
3 D# q5 Z: d0 @+ [& R: D1 K4 o9 c5 A+ H, K
青、链霉素母液5mL（终浓度达：100U/mL青霉素；100µg/mL链霉素），0 h$ t& K, H# O4 U. W5 N
& o1 t$ g1 \* e6 R
HEPES缓冲液12.5mL（终浓度：25mM）。
~ q. z# x8 F' Z8 _/ {; j4 ]( `6 b& _. x% q7 k5 n1 Z
7.5%牛血清白蛋白组分Ⅴ 12.5mL
1 ~1 x+ r5 }7 I" \8 T1 e$ T0 ?0 u; A- X: M/ @
2. 细胞生长液的准备
! q2 s8 `7 K9 v$ k% x( B5 f5 g' \) E {
胎牛血清10mL加到90mL的上述（1）的液体中，使胎牛血清的终浓度为10%。0 T1 }9 s) K5 u: E" ?' x
3 J! Y" l) D3 ?' O+ U) ^
3. 首先将细胞培养瓶中的培养液弃去，加入5mL在37℃水浴中预热的EDTA-胰酶。
4 V- S0 \' j( x. o* w$ v1 ^$ }; A. e
4. 温和地摇动细胞瓶1min，使EDTA-胰酶均匀分布在整个细胞薄层。然后用移液管吸去EDTA胰酶。3 [/ _' F: _ F ^: ]7 S
9 L, ?, H8 z* Y9 Z8 j8 J5 @9 X5. 重新加入5mL在37℃水浴中预热的EDTA-胰酶重复上述步骤。( u( U% g( k! [, f; O
6 i. m+ o2 t" O0 @: [2 b1 Q6. 加入1mLEDTA-胰酶使其均匀分布在整个细胞薄层，37℃孵育细胞瓶直至细胞从塑料细胞瓶的表面分离（约5～10min）。必要时可以摇动或吹打来分离细胞。然后加入1mL胎牛血清灭活残余的胰酶。$ A& n: @7 D" Z* d
9 e5 o: J: E ^' ~- K ]# d+ |. f
7. 加9mL已经配置好的含有L-谷氨酸的D-MEM培养液，轻轻用移动移液管来吹散细胞团。
. D; K4 ^1 ~- { m0 I% c
: h" \, _* G" @# I! P8. 取10mL混合物加到90mL细胞生长液（细胞悬液的浓度大约为每毫升含105细胞）
9 D8 d! z' C! }* g: K1 i
* I g, l3 \$ }, \1 M5 W+ X7 a( z9. 每个T25细胞培养瓶加入6mL（6×105/mL）细胞悬液，剩余的细胞悬液可以加到T75细胞瓶用于细胞传代。通常6mL细胞悬液2～3日可生长成片（80％～90％）的单层细胞。
+ n4 H0 I4 C; i9 t' f- O( y5 e* U% |- w/ d
10. 于37℃，5%CO2培养箱里培养细胞，每天观察细胞状态，以供进一步实验用。
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发表于 2015-12-17 08:53
