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本帖最后由 细胞海洋 于 2016-2-16 09:55 编辑 % F+ N! g0 i! w. u7 f; m
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1 目的：保证Car-T细胞制备和培养符合要求。
& j. @" v2 f" r5 L$ V2 范围：适用于符合实验的要求患者外周血制备和培养
$ d' ?) v6 n0 A! F1 N- D3 责任人：实验员人、临床相关人员。2 S/ J- G' E* |3 C* G+ l
4 内容8 ]3 A5 |4 b6 `5 T
4.1耗材：50ml离心管，10ml移液管，5ml移液管，75cm2培养瓶，150 cm2培养瓶，EP管，1.8ml冻存管5 ]; W+ n" X8 g/ X) I: e4 n* C- F
4.2试剂：X-VIVO 15TM，PBS缓冲液，75%医用酒精，人淋巴细胞分离液，CD3/CD28免疫磁珠，IL-2，注射用人血白蛋白。
3 U- W% U4 q7 d8 X* K- w4.3环境： m5 |' g5 x& w. H1 T
4.3.1外周血分离，培养应在恒温恒湿的万级层流室内进行，开放操作必须在百级生物安全柜内进行。
7 o* ^1 f9 J, ^# e' o4.3.2实验人员应提前对净化室和生物安全柜进行杀菌消毒，紫外线照射时间不少于30min，消毒消毒后，净化空调开启时间不少于30min，生物安全柜运行稳定后方可操作。! Z4 a; L) U3 [3 T& S
4.4操作：/ S% c! u8 l8 H9 |) {: n
4.4.1采集接收外周血
9 B9 @! G$ T5 z' c4.4.1.1患者符合治疗方案，各项检测符合要求，采集患者外周血60-80ml。( Y: i- U4 v' f2 N
4.4.1.2接收外周血并填写《外周血采集交接记录》，核对外周血患者相关信息，及相应检测报告，报告由医院提供，至少包括：HBsAg，HCVAb，HIVAb，Anti-TP，ALT。
$ z; y3 Q8 [: h) F3 ?. h4.4.2操作前准备6 e/ S8 n, R$ q, d3 s
4.4.2.1净化室，生物安全柜消毒完毕后，开启净化空调运行30min，生物安全柜运行稳定。2 T8 u6 ~ Q& O/ P( T: l
4.4.2.2从试剂间冰箱中取出细胞培养基，恢复室温。7 c$ G, D- _6 f
4.4.2.3生物安全柜表面75%酒精消毒，外周血袋表面酒精消毒转入安全柜内。. k8 a7 q i8 _7 h7 ?5 r
4.4.3 分离单个核细胞（PBMC）：
- u; }7 m* `' H+ s4.4.3.1使用灭菌消毒的剪刀剪断血袋塑料管或者使用一次性注射器，把血袋内外周血转入50ml离心管中。
( U! O& @# t7 c# i# g, S4.4.3.2用PBS缓冲液按1:1稀释外周血，混匀。
4 \( i8 R7 K3 n) l; ]4 u1 a4.4.3.3将稀释好的血样缓慢加入室温的15ml人淋巴细胞分离液的离心管中。方法如下：用10ml移液管吸取血样，伸至分离液液面上方0.5cm处，血样自然滑落铺至分离液面上，然后轻轻加入血样，注意不要冲破液面。, o# L5 I& k5 b$ ?& y$ q1 H+ g3 _
4.4.3.4配平离心1200g（2100r/min）离心20min，慢升慢降。
3 \. I. u9 S2 Y4.4.3.5离心完成后，离心管出现明显分层由下至上：红细胞层，粒细胞层，Ficoll层，单个核细胞层和血浆层。吸取血浆层至距白膜层5mm左右处弃之。小心吸取红细胞层以上的所有液体至离心管中，PBS稀释，与细胞悬液体积比应大于1:3，混匀。
/ \/ G. I$ |+ Z' v' |# E; `7 Z4.4.3.6离心600g（1600r/min）5min，PBS重悬细胞混匀，取少量细胞计数。. j1 S7 _8 X% t# S8 x1 {
4.4.3.7离心300g（1200r/min）5min，上清液送检无菌检测。
2 k' i' a* i' R$ H4.4.4细胞培养：; [% |1 t+ |/ L# |$ d3 V8 E7 H
4.4.4.1细胞培养条件：恒温37℃，CO2浓度 5%，相对饱和湿度95%，细胞培养基PH值7.2-7.4。4 x. ]/ p& m! S
4.4.4.2根据细胞计数调密度2x106/ml加入培养瓶中（T150 200x106/100ml, T75 100x106/50ml ,T25 50x106/25ml）。混匀放入CO2培养箱培养2小时。+ Q! E9 d% Z$ s: s9 h3 `3 H* k& U
4.4.4.3取出培养瓶，轻摇，使沉降于底部的悬浮细胞浮起，培养瓶倾斜30度角，移液管吸取培养基转入离心管中，少些培养基洗培养瓶将悬浮细胞全部收集，混匀计数。: y% z, F8 G9 \! B& U/ Y
4.4.4.4根据细胞计数调整细胞浓度1.2x106/ml接种培养瓶中（100-120ml in a T150，50-60ml in a T75，15-29ml in a T25），加CD3/CD28磁珠，按细胞与磁珠比例为1:3（加之前磁珠用培养基洗涤3次，去除保存液），加入IL-2 100U/ml，混匀放入CO2培养箱培养。; h8 p; {% l6 k( ]7 `
4.4.4.5次日细胞培养1天，调整细胞密度至0.6x106/ml，加入病毒（MOI为1-5）混匀放入CO2培养箱培养。
; H: q6 @4 p2 f" ]" j, k0 ]4.4.4.6细胞培养3天，细胞计数补加培养基，IL-2 100U/ml细胞密度调整至0.6x106/ml继续培养。
: Z5 t7 q5 a9 S/ U2 z4.4.4.7细胞培养5天去磁珠，细胞混匀转离心管中，在磁力架上去除磁珠，细胞计数补加培养基，IL-2 100U/ml细胞密度调整至0.6x106/ml继续培养。2 b4 {/ H5 f6 m6 D# |
4.4.4.8定期观察细胞生长情况，主要观察其形态的变化，数目及增值情况，细胞碎片及杂质情况，每2-3天加液培养。
1 I& J' D. B {4.4.4.9根据细胞状态和临床治疗需要，培养9天时细胞数量达到要求，各项检测合格。包括：无菌检测，内毒素检测，细胞活力，细胞表型等。7 F) z% Z& A+ y* q- T; z |
4.4.5 Car-T细胞收集：0 t- h4 Z$ Q( d; h9 P- g/ o- I
4.4.5.1确认细胞各项检测己符合要求。
0 R" }3 E3 K* n$ ?, N4 |4.4.5.2根据治疗方案（一般一个疗程分多次回输，间隔时间为1天），取出相应细胞悬液，剩余细胞补加培养基继续培养，供再次回输。
* d ]6 |( l/ S6 H0 V4.4.5.3细胞悬液转入离心管中，300g离心5min。
+ ?8 X9 d' Y+ ]" t% L! |4.4.5.4除去上清培养液，加PBS缓冲液稀释混匀，300g离心5min，弃上清，PBS缓冲液300g/min离心5min。' k$ p( x9 [ e& H0 S
4.4.5.5细胞装袋（一般静脉回输，采用100ml双阀盐水袋），离心完成后取上清，做无菌检测，20ml生理盐水重悬细胞，100μm细胞滤网过滤，取少量细胞悬液进行细胞数量，细胞活率，革兰氏检测，内毒素检测。细胞过滤完成，转入100ml盐水袋中，加5%注射用人血白蛋白，贴上标签，并填写相关记录。
; u- G2 x( u% M6 L+ k2 N% p4.5细胞运输与保存：
, r( L& \8 `* p5 f4 @4.5.1核对细胞标签内容，填写回输发放记录。
! d) @4 S3 K5 P( O( S/ _# B4.5.2细胞盐水袋放置于运输容器内（一般为疫苗箱，4度），填写交接记录表。5 _; n7 t. i' C; c' {5 n' h6 O) R
4.5.3运输人员在运输过程中避免距离震荡，并在规定时间内送到。
1 J" c( t$ Y* z% f9 r, L2 o! r4.5.4细胞运输保存温度保持在4度左右，并在规定时间内回输，如果患者不能按时回输，请及时联系实验技术人员，返回实验室。+ ~+ }& K& L: e, z9 N
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发表于 2016-2-16 09:29
发表于 2016-7-8 17:16
