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本帖最后由 细胞海洋 于 2016-2-16 09:55 编辑 + s/ M% q2 O- @6 j- r
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1 目的：保证Car-T细胞制备和培养符合要求。
6 O. Y$ Q' t- |3 Q( E- w+ {2 范围：适用于符合实验的要求患者外周血制备和培养
: I* U7 K4 J5 _6 @$ q5 ^3 责任人：实验员人、临床相关人员。0 X5 H7 X t& x
4 内容
# q/ u( F& M- Z. h! u9 H5 X4.1耗材：50ml离心管，10ml移液管，5ml移液管，75cm2培养瓶，150 cm2培养瓶，EP管，1.8ml冻存管1 o1 i4 @& @% @9 J8 A3 m' F
4.2试剂：X-VIVO 15TM，PBS缓冲液，75%医用酒精，人淋巴细胞分离液，CD3/CD28免疫磁珠，IL-2，注射用人血白蛋白。
# z9 ?7 V2 |7 z1 B5 k2 `4.3环境：
0 v+ v+ }- K( @5 |% d# K n5 ]4.3.1外周血分离，培养应在恒温恒湿的万级层流室内进行，开放操作必须在百级生物安全柜内进行。0 P" Z3 ^) {' O, Q! A
4.3.2实验人员应提前对净化室和生物安全柜进行杀菌消毒，紫外线照射时间不少于30min，消毒消毒后，净化空调开启时间不少于30min，生物安全柜运行稳定后方可操作。+ f5 x2 I$ j* V9 ~& u1 { Z% p
4.4操作：
5 z; t+ Z7 w& D) G7 A0 T4.4.1采集接收外周血
; b t1 l4 @0 _1 D$ \% x4.4.1.1患者符合治疗方案，各项检测符合要求，采集患者外周血60-80ml。
8 a4 U( B8 c3 Q/ l% V% n1 z4.4.1.2接收外周血并填写《外周血采集交接记录》，核对外周血患者相关信息，及相应检测报告，报告由医院提供，至少包括：HBsAg，HCVAb，HIVAb，Anti-TP，ALT。# m8 F; Z5 j9 _1 M3 P+ l7 i: V
4.4.2操作前准备+ s2 g4 k! i p1 \2 p- z3 \
4.4.2.1净化室，生物安全柜消毒完毕后，开启净化空调运行30min，生物安全柜运行稳定。! T& j" y% q8 b# d# a1 F
4.4.2.2从试剂间冰箱中取出细胞培养基，恢复室温。
; N0 i, U) T& X5 X* ~8 N4 k% @4.4.2.3生物安全柜表面75%酒精消毒，外周血袋表面酒精消毒转入安全柜内。
+ L1 `. F8 D9 a# ? J" S% a4.4.3 分离单个核细胞（PBMC）：! }5 a* J7 F1 f4 k0 A8 I1 i
4.4.3.1使用灭菌消毒的剪刀剪断血袋塑料管或者使用一次性注射器，把血袋内外周血转入50ml离心管中。
( m3 R+ ~( U! u4 ?" ?4.4.3.2用PBS缓冲液按1:1稀释外周血，混匀。 L3 P- Q6 A- J) {4 K/ p D# y3 Q
4.4.3.3将稀释好的血样缓慢加入室温的15ml人淋巴细胞分离液的离心管中。方法如下：用10ml移液管吸取血样，伸至分离液液面上方0.5cm处，血样自然滑落铺至分离液面上，然后轻轻加入血样，注意不要冲破液面。
+ p/ @- Z! g0 V# s4.4.3.4配平离心1200g（2100r/min）离心20min，慢升慢降。
) [( A, E5 R1 m6 r% ~4.4.3.5离心完成后，离心管出现明显分层由下至上：红细胞层，粒细胞层，Ficoll层，单个核细胞层和血浆层。吸取血浆层至距白膜层5mm左右处弃之。小心吸取红细胞层以上的所有液体至离心管中，PBS稀释，与细胞悬液体积比应大于1:3，混匀。
! p4 G9 k+ O6 f, [7 P4.4.3.6离心600g（1600r/min）5min，PBS重悬细胞混匀，取少量细胞计数。
3 r, q% T0 \" J1 u! S2 o/ ^# w4.4.3.7离心300g（1200r/min）5min，上清液送检无菌检测。5 ]* v) S8 y1 c' X# }! r
4.4.4细胞培养：% ~* ~' x- A2 w; c1 h
4.4.4.1细胞培养条件：恒温37℃，CO2浓度 5%，相对饱和湿度95%，细胞培养基PH值7.2-7.4。
) K2 I# i" T% R* B4.4.4.2根据细胞计数调密度2x106/ml加入培养瓶中（T150 200x106/100ml, T75 100x106/50ml ,T25 50x106/25ml）。混匀放入CO2培养箱培养2小时。
; e- F% P7 c6 I' k: V! t1 b4.4.4.3取出培养瓶，轻摇，使沉降于底部的悬浮细胞浮起，培养瓶倾斜30度角，移液管吸取培养基转入离心管中，少些培养基洗培养瓶将悬浮细胞全部收集，混匀计数。) T7 L r Q4 b- Z8 T
4.4.4.4根据细胞计数调整细胞浓度1.2x106/ml接种培养瓶中（100-120ml in a T150，50-60ml in a T75，15-29ml in a T25），加CD3/CD28磁珠，按细胞与磁珠比例为1:3（加之前磁珠用培养基洗涤3次，去除保存液），加入IL-2 100U/ml，混匀放入CO2培养箱培养。
. ]0 i. D. Q% L3 S4.4.4.5次日细胞培养1天，调整细胞密度至0.6x106/ml，加入病毒（MOI为1-5）混匀放入CO2培养箱培养。; c; @6 l, t) Z: Y9 ~2 t j- H
4.4.4.6细胞培养3天，细胞计数补加培养基，IL-2 100U/ml细胞密度调整至0.6x106/ml继续培养。
5 i. b$ B7 y( S, c4.4.4.7细胞培养5天去磁珠，细胞混匀转离心管中，在磁力架上去除磁珠，细胞计数补加培养基，IL-2 100U/ml细胞密度调整至0.6x106/ml继续培养。9 o9 m& d. G f3 |5 }; q6 Y
4.4.4.8定期观察细胞生长情况，主要观察其形态的变化，数目及增值情况，细胞碎片及杂质情况，每2-3天加液培养。/ n* L; V6 c5 N. Z) Z
4.4.4.9根据细胞状态和临床治疗需要，培养9天时细胞数量达到要求，各项检测合格。包括：无菌检测，内毒素检测，细胞活力，细胞表型等。
# Z {9 q+ ?- k+ c6 g4.4.5 Car-T细胞收集：
7 ~9 }3 b: C7 G4.4.5.1确认细胞各项检测己符合要求。
0 A" h9 T$ d: y5 J+ \* F4.4.5.2根据治疗方案（一般一个疗程分多次回输，间隔时间为1天），取出相应细胞悬液，剩余细胞补加培养基继续培养，供再次回输。% n+ S9 I J! K7 h, O- ]
4.4.5.3细胞悬液转入离心管中，300g离心5min。2 M1 F% S: e6 h2 J8 Y; \
4.4.5.4除去上清培养液，加PBS缓冲液稀释混匀，300g离心5min，弃上清，PBS缓冲液300g/min离心5min。
( L2 H# _$ b7 L( Z7 @) R: b4.4.5.5细胞装袋（一般静脉回输，采用100ml双阀盐水袋），离心完成后取上清，做无菌检测，20ml生理盐水重悬细胞，100μm细胞滤网过滤，取少量细胞悬液进行细胞数量，细胞活率，革兰氏检测，内毒素检测。细胞过滤完成，转入100ml盐水袋中，加5%注射用人血白蛋白，贴上标签，并填写相关记录。5 K0 w# U9 y3 O4 h9 s/ p% p
4.5细胞运输与保存：8 p/ Y4 @$ F0 u: K4 Y! ^
4.5.1核对细胞标签内容，填写回输发放记录。3 |4 ]. G, t( a2 I' ~
4.5.2细胞盐水袋放置于运输容器内（一般为疫苗箱，4度），填写交接记录表。
& p0 q4 V9 ~8 \4 ~0 J! X4.5.3运输人员在运输过程中避免距离震荡，并在规定时间内送到。
# w+ y) i- Q+ V) ^% ?0 }4.5.4细胞运输保存温度保持在4度左右，并在规定时间内回输，如果患者不能按时回输，请及时联系实验技术人员，返回实验室。+ _2 W4 d. K. L, v. n: F
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发表于 2016-2-16 09:29
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