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本帖最后由 细胞海洋 于 2016-2-16 09:55 编辑
3 l, ]6 s* \9 [! C/ `+ G8 X& o S, L" R) C/ k
1 目的：保证Car-T细胞制备和培养符合要求。
/ z% z8 d7 L3 ]- \4 c2 Y2 范围：适用于符合实验的要求患者外周血制备和培养
4 U$ B- I3 \9 ?6 m d* A9 W3 责任人：实验员人、临床相关人员。
/ ]/ z1 R# K3 b8 A( ^+ Q% M4 内容( g8 M z1 E3 A7 H# L
4.1耗材：50ml离心管，10ml移液管，5ml移液管，75cm2培养瓶，150 cm2培养瓶，EP管，1.8ml冻存管
. V% ]$ l' Y9 L4 ~; q8 u3 T2 o" @( L4.2试剂：X-VIVO 15TM，PBS缓冲液，75%医用酒精，人淋巴细胞分离液，CD3/CD28免疫磁珠，IL-2，注射用人血白蛋白。1 _: {5 p) `- b
4.3环境：
8 l8 h" r* E6 N$ K! l- |4.3.1外周血分离，培养应在恒温恒湿的万级层流室内进行，开放操作必须在百级生物安全柜内进行。
; j7 [" o- ~& M4.3.2实验人员应提前对净化室和生物安全柜进行杀菌消毒，紫外线照射时间不少于30min，消毒消毒后，净化空调开启时间不少于30min，生物安全柜运行稳定后方可操作。2 v# s/ ?) |1 J' B* o7 L
4.4操作：# x" T6 l* ?6 h9 E
4.4.1采集接收外周血2 G- c e: z3 ]- E5 a6 S
4.4.1.1患者符合治疗方案，各项检测符合要求，采集患者外周血60-80ml。9 K5 l' S4 z# }+ |" [
4.4.1.2接收外周血并填写《外周血采集交接记录》，核对外周血患者相关信息，及相应检测报告，报告由医院提供，至少包括：HBsAg，HCVAb，HIVAb，Anti-TP，ALT。
! q# B) f b2 b$ i0 \ r4.4.2操作前准备
6 S. h1 z/ j5 Z; ~- _4 V z s4.4.2.1净化室，生物安全柜消毒完毕后，开启净化空调运行30min，生物安全柜运行稳定。
' [% V& Q) Z( ~# F* G+ {. ?4.4.2.2从试剂间冰箱中取出细胞培养基，恢复室温。$ g* x: d( n, F6 S
4.4.2.3生物安全柜表面75%酒精消毒，外周血袋表面酒精消毒转入安全柜内。3 j. z8 ^! M( T
4.4.3 分离单个核细胞（PBMC）：
0 o$ |, o s# }6 _! v8 z6 [0 t4.4.3.1使用灭菌消毒的剪刀剪断血袋塑料管或者使用一次性注射器，把血袋内外周血转入50ml离心管中。
) n! J& |. G' g0 p& ~5 ]4.4.3.2用PBS缓冲液按1:1稀释外周血，混匀。
% h1 D- k% i+ T7 Z5 p- b4.4.3.3将稀释好的血样缓慢加入室温的15ml人淋巴细胞分离液的离心管中。方法如下：用10ml移液管吸取血样，伸至分离液液面上方0.5cm处，血样自然滑落铺至分离液面上，然后轻轻加入血样，注意不要冲破液面。) b0 [& {: M" j: I- P C4 E9 p
4.4.3.4配平离心1200g（2100r/min）离心20min，慢升慢降。
, U5 u$ h& g9 K; h( ^4.4.3.5离心完成后，离心管出现明显分层由下至上：红细胞层，粒细胞层，Ficoll层，单个核细胞层和血浆层。吸取血浆层至距白膜层5mm左右处弃之。小心吸取红细胞层以上的所有液体至离心管中，PBS稀释，与细胞悬液体积比应大于1:3，混匀。: A% A' ?$ w4 n5 m3 c
4.4.3.6离心600g（1600r/min）5min，PBS重悬细胞混匀，取少量细胞计数。
. \4 e# R4 M" b4.4.3.7离心300g（1200r/min）5min，上清液送检无菌检测。! Z7 ?- }9 g9 M' ^4 |& u
4.4.4细胞培养：
& ?" g. u3 X5 ~9 ^4.4.4.1细胞培养条件：恒温37℃，CO2浓度 5%，相对饱和湿度95%，细胞培养基PH值7.2-7.4。: b1 {7 R7 |4 k( O4 C8 g+ l
4.4.4.2根据细胞计数调密度2x106/ml加入培养瓶中（T150 200x106/100ml, T75 100x106/50ml ,T25 50x106/25ml）。混匀放入CO2培养箱培养2小时。
- l$ m) [, l% P6 A4.4.4.3取出培养瓶，轻摇，使沉降于底部的悬浮细胞浮起，培养瓶倾斜30度角，移液管吸取培养基转入离心管中，少些培养基洗培养瓶将悬浮细胞全部收集，混匀计数。 I! K( R& G- u& O" f6 T5 ^+ i. o
4.4.4.4根据细胞计数调整细胞浓度1.2x106/ml接种培养瓶中（100-120ml in a T150，50-60ml in a T75，15-29ml in a T25），加CD3/CD28磁珠，按细胞与磁珠比例为1:3（加之前磁珠用培养基洗涤3次，去除保存液），加入IL-2 100U/ml，混匀放入CO2培养箱培养。
) Z7 c# F8 s% Y: r4.4.4.5次日细胞培养1天，调整细胞密度至0.6x106/ml，加入病毒（MOI为1-5）混匀放入CO2培养箱培养。% z/ I, b# y" U" R; l
4.4.4.6细胞培养3天，细胞计数补加培养基，IL-2 100U/ml细胞密度调整至0.6x106/ml继续培养。- j% r% M9 [2 b G0 }" G
4.4.4.7细胞培养5天去磁珠，细胞混匀转离心管中，在磁力架上去除磁珠，细胞计数补加培养基，IL-2 100U/ml细胞密度调整至0.6x106/ml继续培养。3 n1 ], Z M$ G+ q2 s$ \
4.4.4.8定期观察细胞生长情况，主要观察其形态的变化，数目及增值情况，细胞碎片及杂质情况，每2-3天加液培养。
; O$ m0 e$ Q/ H- L4.4.4.9根据细胞状态和临床治疗需要，培养9天时细胞数量达到要求，各项检测合格。包括：无菌检测，内毒素检测，细胞活力，细胞表型等。# e) l# u. ~ e. g/ M) R
4.4.5 Car-T细胞收集：
: p2 x9 l( D3 s0 {& Y- P( c r9 N4.4.5.1确认细胞各项检测己符合要求。3 N9 l6 C( [1 E
4.4.5.2根据治疗方案（一般一个疗程分多次回输，间隔时间为1天），取出相应细胞悬液，剩余细胞补加培养基继续培养，供再次回输。6 c0 L: O- I) y$ q3 l; a* b2 X
4.4.5.3细胞悬液转入离心管中，300g离心5min。 X8 c' \! U( L# e% d
4.4.5.4除去上清培养液，加PBS缓冲液稀释混匀，300g离心5min，弃上清，PBS缓冲液300g/min离心5min。
* C/ }% C, x! |" F& h5 @4.4.5.5细胞装袋（一般静脉回输，采用100ml双阀盐水袋），离心完成后取上清，做无菌检测，20ml生理盐水重悬细胞，100μm细胞滤网过滤，取少量细胞悬液进行细胞数量，细胞活率，革兰氏检测，内毒素检测。细胞过滤完成，转入100ml盐水袋中，加5%注射用人血白蛋白，贴上标签，并填写相关记录。
& M% h" T- d, [0 y y% ^. N0 [4.5细胞运输与保存：
* ?. d7 y% c$ V; y- H i7 f; \2 H( F5 k4.5.1核对细胞标签内容，填写回输发放记录。9 C- O7 G' Z7 F2 F1 Q
4.5.2细胞盐水袋放置于运输容器内（一般为疫苗箱，4度），填写交接记录表。
a; ^* [, ^9 L e+ K4.5.3运输人员在运输过程中避免距离震荡，并在规定时间内送到。& X, T( k& j$ g( k
4.5.4细胞运输保存温度保持在4度左右，并在规定时间内回输，如果患者不能按时回输，请及时联系实验技术人员，返回实验室。8 G+ b! B) f7 [# f" ?1 H; Y
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发表于 2016-2-16 09:29
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