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本帖最后由 细胞海洋 于 2016-2-16 09:55 编辑 6 I9 R+ l( W2 e
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1 目的：保证Car-T细胞制备和培养符合要求。6 q8 n( a4 |0 ]; p; }6 H; b: S
2 范围：适用于符合实验的要求患者外周血制备和培养
" m! S/ l; H4 P6 U2 ]* O% Q, P6 E3 责任人：实验员人、临床相关人员。; ^0 \! x/ J2 B4 o6 N/ F0 x
4 内容 N N2 X- }# X: }
4.1耗材：50ml离心管，10ml移液管，5ml移液管，75cm2培养瓶，150 cm2培养瓶，EP管，1.8ml冻存管5 P" j) ]0 q: g0 h ?
4.2试剂：X-VIVO 15TM，PBS缓冲液，75%医用酒精，人淋巴细胞分离液，CD3/CD28免疫磁珠，IL-2，注射用人血白蛋白。" ?( w2 x# c1 }- y; B: e/ e
4.3环境：
) Z7 r* U# l8 ~: w% r4.3.1外周血分离，培养应在恒温恒湿的万级层流室内进行，开放操作必须在百级生物安全柜内进行。9 Q6 X2 f4 ]5 w& L) x) a, [: b- d
4.3.2实验人员应提前对净化室和生物安全柜进行杀菌消毒，紫外线照射时间不少于30min，消毒消毒后，净化空调开启时间不少于30min，生物安全柜运行稳定后方可操作。" L: E, N0 F; }' u+ ~2 U
4.4操作：
4 w4 ~& m* d7 C: C4 l4 |4.4.1采集接收外周血
5 ]; X* H4 H- S5 e+ P# w4.4.1.1患者符合治疗方案，各项检测符合要求，采集患者外周血60-80ml。
- P' a0 z+ \+ G' x7 Q, [4.4.1.2接收外周血并填写《外周血采集交接记录》，核对外周血患者相关信息，及相应检测报告，报告由医院提供，至少包括：HBsAg，HCVAb，HIVAb，Anti-TP，ALT。
. n; z' l5 r+ Y7 x& Y \! d4.4.2操作前准备5 i0 V) d7 q2 a9 J
4.4.2.1净化室，生物安全柜消毒完毕后，开启净化空调运行30min，生物安全柜运行稳定。; Q& v% e1 q* [& q0 e
4.4.2.2从试剂间冰箱中取出细胞培养基，恢复室温。' ^) y0 q- _% I S0 ^6 s
4.4.2.3生物安全柜表面75%酒精消毒，外周血袋表面酒精消毒转入安全柜内。
. b/ U3 W3 y$ g4.4.3 分离单个核细胞（PBMC）：
9 ~3 a& L- ~; Y2 n: w4.4.3.1使用灭菌消毒的剪刀剪断血袋塑料管或者使用一次性注射器，把血袋内外周血转入50ml离心管中。# F& A: u4 c, o, P
4.4.3.2用PBS缓冲液按1:1稀释外周血，混匀。8 c) q6 L9 U( H! x' T
4.4.3.3将稀释好的血样缓慢加入室温的15ml人淋巴细胞分离液的离心管中。方法如下：用10ml移液管吸取血样，伸至分离液液面上方0.5cm处，血样自然滑落铺至分离液面上，然后轻轻加入血样，注意不要冲破液面。0 w/ g$ |' J8 ]; ~8 S
4.4.3.4配平离心1200g（2100r/min）离心20min，慢升慢降。) B# p: \6 g, b% m- P2 o
4.4.3.5离心完成后，离心管出现明显分层由下至上：红细胞层，粒细胞层，Ficoll层，单个核细胞层和血浆层。吸取血浆层至距白膜层5mm左右处弃之。小心吸取红细胞层以上的所有液体至离心管中，PBS稀释，与细胞悬液体积比应大于1:3，混匀。
0 C6 u/ Z) z! X4.4.3.6离心600g（1600r/min）5min，PBS重悬细胞混匀，取少量细胞计数。
0 e( o0 ?* ], _( Z+ y& x! Y5 e5 _2 e4.4.3.7离心300g（1200r/min）5min，上清液送检无菌检测。
6 Z0 g7 X; _9 X$ G4.4.4细胞培养：; p# x4 ^4 f7 S# d
4.4.4.1细胞培养条件：恒温37℃，CO2浓度 5%，相对饱和湿度95%，细胞培养基PH值7.2-7.4。% U C- {) }- c$ h
4.4.4.2根据细胞计数调密度2x106/ml加入培养瓶中（T150 200x106/100ml, T75 100x106/50ml ,T25 50x106/25ml）。混匀放入CO2培养箱培养2小时。8 f n( q8 @: @3 H9 q
4.4.4.3取出培养瓶，轻摇，使沉降于底部的悬浮细胞浮起，培养瓶倾斜30度角，移液管吸取培养基转入离心管中，少些培养基洗培养瓶将悬浮细胞全部收集，混匀计数。
- p1 D* I9 Y" b1 Z4.4.4.4根据细胞计数调整细胞浓度1.2x106/ml接种培养瓶中（100-120ml in a T150，50-60ml in a T75，15-29ml in a T25），加CD3/CD28磁珠，按细胞与磁珠比例为1:3（加之前磁珠用培养基洗涤3次，去除保存液），加入IL-2 100U/ml，混匀放入CO2培养箱培养。# d, n8 Z: ~2 R; H! u
4.4.4.5次日细胞培养1天，调整细胞密度至0.6x106/ml，加入病毒（MOI为1-5）混匀放入CO2培养箱培养。
7 D/ g; O+ j4 g: N4.4.4.6细胞培养3天，细胞计数补加培养基，IL-2 100U/ml细胞密度调整至0.6x106/ml继续培养。, V$ @& ^+ c$ C, v
4.4.4.7细胞培养5天去磁珠，细胞混匀转离心管中，在磁力架上去除磁珠，细胞计数补加培养基，IL-2 100U/ml细胞密度调整至0.6x106/ml继续培养。
) W# P) \$ v5 s) k; `4.4.4.8定期观察细胞生长情况，主要观察其形态的变化，数目及增值情况，细胞碎片及杂质情况，每2-3天加液培养。+ H% X8 e) _( m8 p
4.4.4.9根据细胞状态和临床治疗需要，培养9天时细胞数量达到要求，各项检测合格。包括：无菌检测，内毒素检测，细胞活力，细胞表型等。$ s$ Y; K& U! X
4.4.5 Car-T细胞收集：
8 a, {# r$ A& e. e' ?- {% m4.4.5.1确认细胞各项检测己符合要求。
# g8 D4 G' b; c; \6 B# @4.4.5.2根据治疗方案（一般一个疗程分多次回输，间隔时间为1天），取出相应细胞悬液，剩余细胞补加培养基继续培养，供再次回输。0 A6 z1 O& j/ Y& t. Q4 b. \5 ?8 W
4.4.5.3细胞悬液转入离心管中，300g离心5min。
6 F2 Y5 W- K! X$ J- n* l4.4.5.4除去上清培养液，加PBS缓冲液稀释混匀，300g离心5min，弃上清，PBS缓冲液300g/min离心5min。
. x; r# |( ~" ]1 a* n# N5 F4.4.5.5细胞装袋（一般静脉回输，采用100ml双阀盐水袋），离心完成后取上清，做无菌检测，20ml生理盐水重悬细胞，100μm细胞滤网过滤，取少量细胞悬液进行细胞数量，细胞活率，革兰氏检测，内毒素检测。细胞过滤完成，转入100ml盐水袋中，加5%注射用人血白蛋白，贴上标签，并填写相关记录。) J5 X, S. Q6 i4 R- ]6 B- L
4.5细胞运输与保存： g8 b/ S' }; D q d* @
4.5.1核对细胞标签内容，填写回输发放记录。
/ G! q4 I& A0 g$ E* E' g4.5.2细胞盐水袋放置于运输容器内（一般为疫苗箱，4度），填写交接记录表。; k) I2 x( M( x: X
4.5.3运输人员在运输过程中避免距离震荡，并在规定时间内送到。
8 B0 W. O* \ d1 f, @4.5.4细胞运输保存温度保持在4度左右，并在规定时间内回输，如果患者不能按时回输，请及时联系实验技术人员，返回实验室。( X6 u9 [" y$ Y. v$ [5 H9 v* B
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发表于 2016-2-16 09:29
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