［求助］有关T细胞培养之问题

nailute1985

最近在养T细胞，我们是从cord blood中提的PBMC，然后添加IL2 CD3/28的可溶性抗体刺激，IL2大概500IU／ml， CD3/28 300ng／ml 都是在D0天加的。 现在有几个问题像大家请教一下：0 ?  ~: s) ]$ J2 O" @
1、现在是D5，细胞增殖很不明显，而且抱团生长十分严重，基本上我吹散了之后，过10分钟左右就又开始抱团了，这正常么？（脐带血当时没有立即处理，4度放了大概20小时左右做的实验）# N6 u& x- ^3 o# M& ?9 w3 V4 D9 C( C
2、本来一开始打算不换液，只补液的，但是从D3开始 培养基发黄了但是细胞数没怎么变，我想还维持原来的细胞密度2*10^6／ml 所以我直接全量换液了，换完液之后补加了IL2，那这个时候我还需要CD3/28再刺激一下嘛？+ o; q. T9 a2 c# x
3、D5计数，细胞数比没换液之前还少。
9 N" k6 U3 z1 P5 R* o! F4 S# `! v求解～

娟姐姐

细胞抱团生长是正常情况

nailute1985

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5 a7 d* I. t' z5 Z( a3 d: M$ B& B2 O
主要是抱团太快了，是T细胞典型的特征么？我觉得其他的悬浮细胞没有这种抱团那么快的

娟姐姐

轻轻拍打培养瓶就散开了，悬浮生长的细胞抱团正常

nailute1985

回复 娟姐姐 的帖子7 e9 Q1 z) {1 M. J5 O# R1 F
' Y( |+ F; C3 I5 B) f
我都是用吹的……

醉心科研

2 a% b3 s. S) Z. i

0 x5 f: u" a! S  y; D# t回复 nailute1985 的帖子
0 D3 D, [) G) t( P  \* j, ^; m4 z: j5 R! q8 t
1 接种密度偏高, w: G6 t( F; m5 I0 {9 h& z
2 前几天不需换液，实在受不了可以补因子。
$ }0 \# b) n' o- X1 O3 前7天计数没有太大参考意义。+ _4 @8 N2 M$ Y; `# B
4 补因子的时间与外周血培养不同，是因为脐血都是这样补法吗

nailute1985

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5 O0 N) u- r$ g, Y0 R" }1 _
+ W: Y5 e, U3 d. N4 T6 M6 c* ?嗯，我也觉得2*10的6稍微有点高，下次1＊10的6就可以了。其实按说应该是补液的，但是因为前几天细胞消耗培养基太快了，但是细胞不怎么增殖，我如果再补液的话，细胞密度就下降了，我还是想维持这个密度，所以我就全量换了，然后补的IL，现在的问题就是，我全量换液之后，我的CD3/28还需不需要刺激？有一种说法是：CD3/28加完之后T细胞已经是处于激活状态了，换液之后就不需要补了，还有一种说法是CD3/28可溶性抗原需要存在于培养基中持续刺激，换液的话就需要加…这两种说法我不知道哪个对。

riverdtang

2*10^6已经接近生长密度上限了，调到1*10^6甚至5*10^5都可以，T细胞抱团生长很正常，不要吹散，成团有助于其分泌有利的生长因子

醉心科研

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/ T0 f5 k1 I; x* N/ v" N9 p! k按外周血T细胞的培养来说，不需要持续加。

nailute1985

嗯嗯 下次我调低点 但是现在我需要计数看看生长曲线，不吹散的话我没办法计数呀，细胞数也不知道了就