定量试验扩增曲线?

gxbzjznn

同一个基因做了两次定量试验，但扩增曲线为什么差别这么大？哪个好？

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对啊 已经根据公式计算过了 80-120%之间都是有效扩增 90-105%是优化扩增 我们的这个扩增效率都是在90-105%没有问题 而且标准曲线的回归系数都是大于0.99  就是不知道问题出在哪里了

wuhuaguo88l

罗氏LC96或LC480只要看一下标准曲线就可以了，我和你其实是一个意思，理论上扩增是2的n次方，实际实验是（1+e）的n次方，e是扩增效率，应该在90%-120%之间是可信的

gxbzjznn

回复 wuhuaguo88l 的帖子) }6 @9 n  {' O5 Z' f
7 s4 K2 P; M7 ~" c
我们实验室用的罗氏的仪器，计算出来的扩增效率都是在90%-120%之间，都是用百分比表示的。您说的这个1.9-2.1也是用罗氏的仪器做的吗？

gxbzjznn

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6 \/ F0 O; L& x( t' `+ g: p. X扩增效率怎么计算的？

wuhuaguo88l

溶解曲线还不错，引物应该还可以。如果是扩增曲线感觉不好，有问题的话，可以将样本10倍往下稀释成3-4个梯度，然后做QPCR，类似于绝对定量，看一下扩增效率怎么样，内参也要用相同方法测一下，若是扩增效率在1.9-2.1之间，实验结果是可信的。

gxbzjznn

回复 sithbj 的帖子9 S4 d( I: _3 J. I* e! o% m
3 _1 Y0 J! e- T& @! A' t- B( j# H
逐个回答你的问题：1.条件确定类似（cDNA浓度几乎一致都是按照定量试验要求的在100-200ng/ul、反应体系以及加样顺序全部一致)。 2.引物确定加了的（两次实验用的同一管引物） 3.2X里面的荧光染料也是SYBR GreenI  但是你说的我还是不明白，求指点。。。。

sithbj

首先2X的效率低了好多数量级。如果条件类似的话，这是一个失败的反应。实验中可能有一个致命的错误。首先2X，是最后加完引物，样本和水后，正好是1X。其次别忘了引物。第三，这个Dye是什麽，波长要对应。2 R( h6 g( [, \# m+ a

! a9 ~7 n) `6 S; g0 }英雄重来一遍吧4 p* L2 |8 b4 B+ p

gxbzjznn

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0 }! @+ h" s3 U+ F+ W: j! d: x
$ n7 V. J9 A. `4 ~( C+ }% ]这是第一次做的溶解曲线 第二次做因为是新的试剂（2X) 由于说明书没看明白 可能程序设置错了 只跑出来扩增曲线 没跑出来溶解曲线

gxbzjznn

这是第一次做的熔解曲线