CAR-T的相关检测

ET生物人

各位大神们，感染完CAR的T细胞后，流式检测检不出CAR的抗体蛋白，但是做QPCR确又能检测出CAR的基因！跪求各位老师解答一下，这是什么的情况？

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当检测不出来的时候，可能原因有俩：
3 b! ]2 H9 ?. i8 ?% @  p1、使用的抗体和你设计的CAR胞外结构无法特异性结合或者特异性太低，这个可以通过阴性对照看出来；: X4 r" x& O. k4 b4 u) V
2、你应该在做下WB，确认下你的CAR分子表达是细胞膜表达，还是胞内表达。8 A# H, w; ~$ `# B/ f

luoye1986

haosenna，给你顶一下

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. n9 ^" C. y0 P7 e) C+ M
/ H% S5 H9 H+ x补充下：如果是膜表达的话，阴性对照如果也测不到就是说明抗体有问题，针对性不强。可考虑采用间标的方式试一试，不然就只能重新设计膜外的ScFV，或者换抗体了。

ET生物人

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5 e; l! Q. A: S8 H: J
1 ?1 `- J- O% _3 Z$ e3 u7 y" F你是谁！！！

ET生物人

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5 [( G' P0 r3 X6 H! o, q+ N
) K2 Q# l2 X+ x: y5 N' s7 O一直有做，应该不是抗体的问题！！WB也不能检测蛋白是否表达胞膜或膜内吧！！只能表达蛋白是否存在

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回复 ET生物人 的帖子) S* Z7 u( P3 @. g
. X. W. R) z$ N) g$ n* i! L# |. Y
弱弱的问下：
. U# G6 m0 d/ P' L8 m$ _/ K1、分别提取细胞膜蛋白和核蛋白，做WB，不能确定其是否为膜表达？
. }5 M6 q% s0 J3 L! B2、如果你确定抗体和你的设计都没问题，流式检测为什么不试试细胞打孔标记检测？如果胞内表达，这应该可以测出来。2 s) V$ E+ z) ~" l& v  y/ u3 o
3、我想问下，CAR分子设计的胞外部分，抗体针对的是哪一部分？跨膜区？Linker？现成的抗体都针对的特定区域的特定部分，这里设计真的很重要。

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我看几个大牛做的CART检测抗体很多都是自己实验室制备的，而不是直接买的，这是否也可以说明一点问题？

ET生物人

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( j9 K0 a" l/ }' ^1 \. T9 n) C5 ~. l& i/ e  l0 {( a
额。。7 z/ i/ f8 W: b  y
1、没想到膜蛋白跟核蛋白分开提取
9 q. ]; c! B2 R2、细胞打孔标记检测没听过这个方法+ z  o( H* h- s
3、我们设计的是Fab抗体 间标的

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) r- O( c, ]  k

  g" J9 F: E* [/ V回复 ET生物人 的帖子
9 [& W* N3 u% d' d; j7 b
6 w4 z9 ?) D7 ~8 m间标检测的话，特异性必须好，同型对照很重要，关于打孔检测，已经算常规方法了。比如测Treg的FoxP3一般都需要打孔。
' P  B7 t6 g0 q3 J4 _你还可以尝试做做免疫荧光染色，看看细胞表达情况怎么样。表达丰度是否合适，太低的话，可能对流式检测也不利。6 |: ?9 S" O/ w" R: q" ^( j
这对载体和不同种类启动子等要求都比较高。所以设计的时候都必须检测，选择合适启动子和载体。