扩增一个基因的片段扩增不出来

微笑流滢

是怎么回事呢？成弥散状！[img][/img]

niliu730323143

重新设计引物

细胞海洋

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: @# x6 u1 P( M2 ^0 H9 C9 o( H; W, n% ?7 J5 p& T
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微笑流滢

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1 W+ f. B/ d; j5 B" I' L6 V8 m9 `
( \$ o, \1 K1 u5 G重新设计了两对，而且也用梯度PCR扩增了，也是弥散，模板也换了

微笑流滢

回复 微笑流滢 的帖子8 o) s' K' t7 j! R5 k
! S6 n" w; F6 o; Q  h8 i& x/ A2 P
这是图片

niliu730323143

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  |2 U5 F# d! g( e0 f' H
1 e0 m5 ?9 U% }7 y引物的GC含量，退火温度，延伸时间，这三个注意下，看看你自己的酶有没有失效啊。

gscao

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2 Q& N' F+ i! s+ {
换好使的Taq酶，可能会有效果。

innatestem

针对你的问题，给你几个建议：一.重新设计引物；二.多选取几种不同的模版；三.使用扩增性，保真性更好的 DNA聚合酶（我们一般用的是全式金公司的Fast Pfu，Takara公司的DNA聚合酶）；四.你扩增的目的基因是否具有一些特殊结构，或者具有高GC含量，这种情况下建议你选用适合高GC含量模版的DNA聚合酶（Takara公司有适用于高GC含量的DNA聚合酶）。祝好！

微笑流滢

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' k$ R' K7 [( a% d5 Z  ?, g& J. q" ^; H; P8 ]6 p" O4 Y( E
亲，这个基因是高GC还有一些重复序列，，该如何扩增呢？只需要扩增这个基因的2000bp就可以了，但是一直扩不出来。也买了公司的适合于扩增高GC的酶，但是这个酶有自己的PCR程序，我试了试，还是啥都没有，我就用常规的PCR程序试了试，还是不行，崩溃

innatestem

回复 微笑流滢 的帖子" d' p. y0 u+ a  S+ d- n% U

  _$ S8 {: y' T" f  V建议你分段P，最后再拼接出全长的片段。