成脂诱导剂的具体配法!（非常详细）

adonis

做实验，菜鸟一只，谁能指点一下成脂诱导剂具体怎么配呢？郁闷啊
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adonis

诱导脂肪体系  a% w! _9 q- o* M) K  I$ R9 N
1．
- H  D! k, M/ e! ^  J. k2 d) @试 剂   溶 剂   终 浓 度   储 存 浓 1ml体系加量* i8 d% J  [1 _( S& g* S
Dex  去离子水     1μM 1mM   1μL
! j  J  ?  C* G: I, r消炎痛  甲醇   200μM 40mM 5μL
- Y- K' |4 c5 A2 ?3 v$ H" F3 c1 FIBMX3-异丁基-1-甲基黄嘌呤  DMSO  0.5mM   50mM 10μL
0 `% w! j2 n  N胰岛素  2M盐酸   10μg/ml   5mg/ml 2μL
8 z1 U% ]! L; A1 g) E1 |- o) @. b" Z0 ]5 ^
2．DMEM（HG）和10%FBS。* j8 k5 V! h: X  B
3．3代以上细胞，24孔板每孔105个细胞，六孔板每孔104个细胞，每三天半量换液，共诱导2周。

adonis

谢谢楼上!但能不能再说具体点，盐酸是百分之几的呢？

adonis

以下是本人在综合园子里的各方经验，阅读Sigma的说明书，考虑实际操作需要上总结的。注意各个文献所使用的试剂的实际浓度有出入和计算单位有不同，另注意溶剂的浓度和对实验的影响。( H3 V) q) k& I. g% Y0 \7 T  ?9 r

6 c1 K3 K" V; k5 Q材料：DMSO 2N盐酸（此时大多数人的答案，N 是 克当量) 无水乙醇
3 V# M3 R2 J  x, ~0 E/ @消毒好的1毫升EP管 微量加样器 消毒好的小青瓶 / L0 _) T# I. @7 Q: [2 z
消毒好的一次性小滤器，有机系滤膜（消毒前放入滤器一起高压消毒，本人使用尼龙膜），也可以购买一次性的有机系小滤器7 ~! o$ b9 J! w3 Q2 [
一次性5毫升注射器 电子天平
0 `- T+ W6 W% a0 r# `  s" a
& a" L: T: p5 S, Z" J$ w( {  p# ?胰岛素干粉： 2mg加1ml水(盐酸调节水为PH 2.0)( 此为说明书所写），保存温度：-20度。
- E; u8 d. Q$ Q; Z0 _( N! v1.10mg溶于5ml pH2.0的盐酸溶液，浓度为2mg/ml。过滤。( N9 @8 A3 C9 y9 u: B
2.分为20份，每份0.25ml含0.5mg，分装在EP管里，保存在-20度。
( j+ y1 P9 G! R5 ^3.取2份即1mg加入100毫升培养基里，终浓度为10mg/ml。（盐酸为0.5ml.本人已证明对100毫升pH 为7.4的培养基的pH不会有明显影响）! N+ I0 F2 t# e4 m
) M- {( l* D% c7 q- B( v
非水溶性地塞米松干粉（分子量为392.5）：保存在2-8度，在无水乙醇中不需加热溶解度是25 mg/mL 。
: v4 i# a9 V: D0 l1.电子天平称取3.925mg溶于5ml 无水乙醇，浓度为0.785mg /ml=2mMol/L。过滤。
5 p, K' \1 m9 V0 i& x/ z2.分为100份，每份50微升含0.03925mg，分装20份（余下的使用前再分），保存在-20度。" L$ F& p+ B* t/ O$ m
3.取1份即0.03925mg加入100毫升培养基，即终浓度为1M。（无水乙醇为50微升）如果是水溶性的则方便。
3 M$ ~6 r% C- v( O2 \. `+ h8 m9 H
% }2 u- _9 }! t: |IBMX干粉：保存在-20度，在室温下也是稳定的。It is soluble in 100%DMSO at 1 M with gentle warming.4 g: t6 _2 c* t& V' q' _
1.99.9mg（实际包装是100毫克，故是100毫克）溶于2.7ml DMSO中，浓度为55.5mg/ml，过滤。2 [* ?) I% U3 {" V  Z( j2 E; k
2.分为18份，每份为150微升含5.55mg。保存在-20度。5 T+ w+ I+ e/ l- F: G
3.取2份即11.1mg加入100毫升培养基 ，终浓度为0.5毫摩尔/L。（DMSO为300微升。可惜稍微多了点。）
! j; ~! X0 h( Q2 V  F6 Q. q! u- C% q% K( i: J! X% e1 b
以上三种同时加入到100毫升的培养基内，配好的诱导培养基如果短期内用不完，同理分装冷冻。! ~  ^$ P9 S  w0 @8 [: L
本人全部过滤，考虑到在称取试剂时很难无菌操作，进口分装试剂本身和溶剂本身的无菌状态难以肯定。但过滤时滤器会损耗溶液。
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( s( G. M' c& B: L% J" M请使用前阅读Sigma的说明书。个人操作共同分享，恐有不当，仅供参考。

adonis

1.3.取2份即1mg加入100毫升培养基里，终浓度为10微克/ml。（盐酸为0.5ml.本人已证明对100毫升pH 为7.4的培养基的pH不会有明显影响）
" O$ o$ d* g1 Y* p% x4 m- \6 m5 e: I/ m2.3.取1份即0.03925mg加入100毫升培养基，即终浓度为1微摩尔/L 。（无水乙醇为50微升）如果是水溶性的则方便。
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4 E1 ~* I; y5 X! Q. P3 _由于复制时有错误，已改正。

adonis

还想请教楼上师兄一个问题：在有些文献中诱导剂中除了以上三种药物还有消炎痛，请问两种的效果会不会有区别？

adonis

个人没有比较过。文献上报道用三种也可以诱导。此外StemCell Technologies Inc.公司有专门的诱导培养基Product Name: Adipogenic Stimulatory Supplements (Human)。Catalog Number是: 05403，有兴趣可以看看。至于各种诱导成分的具体的作用过程，提供给你一些文献，希望有用。有没有区别可能我回答不了。
# V# B: Q, u6 l0 F 脂肪细胞的分化及调控.pdf (178.36 KB)

2009-8-4 12:03 上传

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4 J  ^( a( f) i0 R5 _2 v/ b" C: I( }
ecular regulation of adipocyte differentiation.pdf (236.16 KB)

2009-8-4 12:04 上传

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adonis

谢谢柳叶刀师兄!!终于可以开始配制了!6 b" ^% j2 c$ u
呃，还想问个问题，你做过油红O染色没？我现在要准备做油红O染色，可是不知道异丙醇要用什么浓度的(有说用60%的)；没有10%的甲醛，可以用95%的酒精代替吗？

adonis

师兄你好!上次多谢你告诉我 怎么配成脂!现在四种药都到齐了可以开始配了，可是又遇到一难题，胰岛素溶解不了~~黑线~我把36%的盐酸稀释了10倍也溶不了--|||--我没有PH仪，所以也测不了盐酸是不是PH=2，所以现在实在是~~~痛苦啊~~~师兄可否拔冗指点一二？多谢!

adonis

请问你的胰岛素是哪个公司的哪个货号啊。sigma的说明书对胰岛素在pH2.0盐酸中的溶解度有清楚说明。不能溶解是否保存不当的原因？* e: P" u7 U, V( }5 d( Y
如果没有PH仪，还真的比较棘手，盐酸的pH跟温度，浓度，稀释剂都有点关系。得问化学的人。
2 l* M& y" a' {% M) _8 r个人认为这里作为溶剂的盐酸只要ph在大概的范围就可以了，只会导致溶解度的波动，尝试用“精密”试纸看看。最好是未开封的。