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本帖最后由 泡沫清风 于 2009-8-20 12:20 编辑 " o4 f1 Z0 N$ r1 b& r: ?# z9 ~; }
0 w k u( L+ z
铺皿后19小时左右，观察细胞密度：
' a( N9 w5 j, [* I% G7 H
6 ]! D3 E2 ]3 a. t1 h6 }8 V* {# Z; W
实验准备：- d8 j4 N- A$ f3 B
1、培养基：DMEM+10%FBS
$ g3 I5 L+ M, Z2 U* k+ a9 m3 O2、lipofectamine 2000 （invitrogen）
. @$ ?7 {' P$ [6 K( g5 C3、OPTI-MEM （GIBCO）$ v$ S8 \+ u: {
4、质粒& ~! m* x5 K @: p8 m
两个目的质粒：MSCV-BCR/ABL-IRES-GFP8 V/ f, E o9 D2 [3 L$ z+ _# Z/ \
MSCV-IRES-GFP5 d" a4 h/ ?& j) M' G) j* Y
两个包装载体：pKat和pCMV-VSVG
1 T# I" S$ j6 Z! L* D
; T+ v7 f, S o实验步骤：& E. N& E+ m5 D* J4 G5 S
1、弃去6个皿中旧培养基，各加入4ml新鲜培养基。
& g9 _7 b6 G$ n* k9 H3 F' Y, }2、制备质粒-lipo 2000混合液：9 |+ ^4 K0 d6 d9 }9 ~& m* q
（一个10cm皿我用质粒的量是10ug，lipo2000的量是20ul，OPTI-MEM 1ml，6个皿中其中4个皿用来转染MSCV-BCR/ABL-IRES-GFP，另外两个皿用来转染MSCV-IRES-GFP作为对照）$ @3 \; |6 i/ Z. i9 `* K
8 A9 t' F7 _: L) W5 K( H6 x （a）取一个4mlEP，加入120ul lipo2000，再加入3ml OPTI-MEM，混匀，室温静止5min。（6个皿的量）
* }. T8 z; `" B9 z- L& u% o （b）取第二个4ml EP，加入MSCV-IRES-GFP 10ug，Kat和VSVG各5ug，加入1ml OPTI-MEM。（2个皿的量）4 v; D. _$ @) P9 q0 x
（c）取第三个4ml EP，加入MSCV-BCR/ABL-IRES-GFP 20ug，Kat和VSVG各10ug，再加入2ml OPTI-MEM。 （4个皿的量）( ]1 |) v6 h/ P# W- V. T! G
（d）取（a）中1ml于（b），其余2ml到（c），混匀，室温静止20min2 u6 W6 _# q' F0 o3 w* d. P
3、在1-4皿中加入（a）与（c）的混合液各1ml，5-6皿加入（a）与（b）的混合液各1ml，注意一滴一滴加入。这样每个皿都为5ml总体积。
/ d6 |5 E- B- O8 ~' F4、放入温箱培养，到6小时时换液。 |
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