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本帖最后由 泡沫清风 于 2009-8-20 12:20 编辑
$ L% l2 H! p8 m+ ]
& i" X. b5 q, j$ [铺皿后19小时左右，观察细胞密度：! D! L: J0 L% ]# u) C6 c. ?; b; @2 S9 z
6 b1 O! k3 U# \" s3 [7 x- l! x3 s E/ L
实验准备：
. r+ a$ \2 s) X) }6 O# V u4 q1、培养基：DMEM+10%FBS. A8 C8 B, X! {) s) }3 Y6 j
2、lipofectamine 2000 （invitrogen）
( B5 e$ M/ P# T& s1 P5 ]3、OPTI-MEM （GIBCO）
/ o# \' T5 }, V) k* g6 ?7 f4、质粒; ~) n2 j5 A+ z# ]
两个目的质粒：MSCV-BCR/ABL-IRES-GFP
9 {8 \7 s0 i; t* F. `1 z+ w1 c- a& k MSCV-IRES-GFP1 _2 o. I' L; R. Q
两个包装载体：pKat和pCMV-VSVG
# \2 C2 i+ t" a/ L5 A. `/ D7 @0 ?
/ ^& k; o) W; `; P" ], y" H实验步骤：
3 C. u2 @, `3 d: B( j3 i! q; f1、弃去6个皿中旧培养基，各加入4ml新鲜培养基。% j1 ^) u& ^6 Z/ z& ^' \% u
2、制备质粒-lipo 2000混合液：. ?# W' h8 w+ p7 ^. m
（一个10cm皿我用质粒的量是10ug，lipo2000的量是20ul，OPTI-MEM 1ml，6个皿中其中4个皿用来转染MSCV-BCR/ABL-IRES-GFP，另外两个皿用来转染MSCV-IRES-GFP作为对照）8 C6 O, P! g! x+ g- O
H3 M5 _: V* S) B. _ （a）取一个4mlEP，加入120ul lipo2000，再加入3ml OPTI-MEM，混匀，室温静止5min。（6个皿的量）2 S- s& j$ W2 X* y) U
（b）取第二个4ml EP，加入MSCV-IRES-GFP 10ug，Kat和VSVG各5ug，加入1ml OPTI-MEM。（2个皿的量）
1 @2 A7 D5 i, A6 l) l （c）取第三个4ml EP，加入MSCV-BCR/ABL-IRES-GFP 20ug，Kat和VSVG各10ug，再加入2ml OPTI-MEM。 （4个皿的量）' [0 y! d: u# w- p
（d）取（a）中1ml于（b），其余2ml到（c），混匀，室温静止20min: r& {1 e6 N. X2 E( _
3、在1-4皿中加入（a）与（c）的混合液各1ml，5-6皿加入（a）与（b）的混合液各1ml，注意一滴一滴加入。这样每个皿都为5ml总体积。
! Z* q; [, K/ ~% @- ~! P4、放入温箱培养，到6小时时换液。 |
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