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本帖最后由 泡沫清风 于 2009-8-20 12:20 编辑 : [( B; C. m; t9 H
8 A4 Z% h. ^' U
铺皿后19小时左右，观察细胞密度：. v) X) N1 N6 N) u/ P
+ w$ ^, @: @* f @
3 K$ Q) X* x4 @" I' T实验准备：
$ O( }; _, y7 Y5 D8 [ H1、培养基：DMEM+10%FBS) E/ P6 ~. M7 a% Y( I
2、lipofectamine 2000 （invitrogen）4 i. L* W8 H/ F- M2 ?$ [/ }
3、OPTI-MEM （GIBCO）
l4 m( {- N. S" O3 A4、质粒
0 g9 \$ G6 D7 p: ^5 ~ 两个目的质粒：MSCV-BCR/ABL-IRES-GFP0 ]* n2 Z! \0 r; M4 X6 l
MSCV-IRES-GFP7 D2 b/ _5 j2 u5 C: a1 H
两个包装载体：pKat和pCMV-VSVG
& P9 A8 q+ h& @6 S3 G) N5 p b( N
9 f9 c9 U& s% e) ]) f0 ]" Y* c1 V4 }+ p实验步骤：
! V4 F5 }% M( M n/ L1、弃去6个皿中旧培养基，各加入4ml新鲜培养基。
6 Z+ D, \8 d0 C& ]' g S! J0 \2、制备质粒-lipo 2000混合液： n1 S% Y& d% V" o3 r+ n1 t# |- v
（一个10cm皿我用质粒的量是10ug，lipo2000的量是20ul，OPTI-MEM 1ml，6个皿中其中4个皿用来转染MSCV-BCR/ABL-IRES-GFP，另外两个皿用来转染MSCV-IRES-GFP作为对照）& P* h+ q+ ?9 |7 [
, [% d# x- Z" _4 _5 G
（a）取一个4mlEP，加入120ul lipo2000，再加入3ml OPTI-MEM，混匀，室温静止5min。（6个皿的量）
9 j( X% \( ]7 a （b）取第二个4ml EP，加入MSCV-IRES-GFP 10ug，Kat和VSVG各5ug，加入1ml OPTI-MEM。（2个皿的量）9 b, q+ ^+ h1 Q' _, f7 e5 q
（c）取第三个4ml EP，加入MSCV-BCR/ABL-IRES-GFP 20ug，Kat和VSVG各10ug，再加入2ml OPTI-MEM。 （4个皿的量）
* Y* H2 A+ `. V （d）取（a）中1ml于（b），其余2ml到（c），混匀，室温静止20min
+ J/ t$ H2 m: Q" ~; e3、在1-4皿中加入（a）与（c）的混合液各1ml，5-6皿加入（a）与（b）的混合液各1ml，注意一滴一滴加入。这样每个皿都为5ml总体积。. k$ Z0 a1 i, E9 a2 u: z
4、放入温箱培养，到6小时时换液。 |
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