如何用PCR扩增长的片段

plando

最近，需要扩增较长的片段，约为7kb，有什么简便易行的好方法？请教！多谢！

ziyunfei1982

选好的PCR用的酶，要求保真性高的，扩增效率好的。分开几段扩增，然后桥接PCR) n% l3 |/ h. H# Z! C- W
会很辛苦，看运气了。

hawkyiger

进行长片段PCR扩增时，引物长度一般为24~34个核苷酸，溶点在60~68℃间。使用这类引物可提高PCR反应的退火温度来增加反应的特异性。这点非常重要，长片段扩增的效果往往受到非特异性短片段优先扩增的影响。

franklinhg

用高保真的PCR聚合酶probest基本可以解决这个问题哈
1 ~. C% N+ R+ m  s2 D* h* u但是实验的时间和工作量都比较大

shihuijunm

+ ~3 U- G* {* e) S/ C
) s! h3 E8 S- F8 p, l
选好的PCR酶，保真性高的,

shihuijunm

选好的PCR酶，保真性高的,譬如Pfu DNA Polymerase ；能满足长片段目的条带扩增的需要。

weiyepan

如果条件比较好的，强烈推荐使用NEB的Phusion酶，1分钟4kb，扩30循环可以50%以上克隆无突变，扩出来片断又浓又干净，本人亲身验证扩增13kb条带，又快又好用；7 h4 i: j, k( H' w5 w+ E
如果条件不是太好，可以用我们公司的HSHF，就是扩出来浓度比不上NEB的，速度和保真性可以保证和NEB的一样，buffer和NEB的比也有自己的优势，可以做出一些他做不出的；! U8 I2 B8 d2 n9 K0 Z
如果是扩基因组，可以用Takara的酶，我们做很多UTR都是用takara的做出来的，NEB的不太行，具体什么原因我也不清楚。; t+ r# I; U% P: @
最后说一句，没有最牛的酶，只有最牛的技术员，哈哈！！# \4 m* E& a$ L) J! r) u
本人PCR牛人，大家交流哈。

weiyepan

回复 3# hawkyiger
3 Z/ t; L: ?, q, p7 ?( @1 {2 i, |/ h另外拍一下hawkyiger的砖，PCR的引物不是看长度论退火的：% d/ ^& X. t8 C8 [" U6 I" U  ~) u) X
首先，引物设计推荐使用Primer Premer 5，直接算引物温度，算出来是比较准的，实际做的时候还可以提高1~2度，有时候引物就算20多个碱基，但是Tm才不到60度，是要看GC含量的；! V: q$ o7 N* ~5 n7 X) l+ n9 y
第二，并不是说TM要在60~68之间的最好，其实如果能拿到短引物，特异性比较高的，就算50多度也是很理想的。有人说长引物特异性高，在我看来这是不对的。长引物更容易引起错配，大家可以自己去想想为什么。错配是可以在Primer Premer 5里面找出来的，如果算出来的自由能>20，那么这个引物已经很难做了，如果自由能>30，我建议重新设引物算了；
, q' W2 n+ n" S第三，如果你的长片断是在基因组或者是逆转录文库里面，我建议就不用做了，因为能扩出来正确的几率微乎其微，还是去找模板实际。这不是酶和引物可以解决的问题。

yueyongheng

个人认为TOYOBO公司的PCR酶系列很不错，尤其是KOD FX 。
$ K2 I8 D: J$ [4 w+ X: ]5 n普通 PCR反应：
# y% @- C1 d6 x/ p- CTaq DNA Polymerase
2 s1 h  ~& }. E7 |/ t+ i0 prTth DNA Polymerase # B6 m! R+ ?( P0 x+ ?. u. q% A6 v! u
高效率 PCR反应：" P8 v9 U: C4 o; E* A
Blend Taq ( G$ U! H# |! |4 Y. G5 B
Blend Taq Taq-Plus Plus-
9 h/ N+ L3 g8 d/ s2 z: V* j1 IKOD Dash (LDP LDP-101)
6 y3 E) M+ A: l9 C7 EKOD KOD-Plus Plus-
+ ?; l, W: H) \& ]- VKOD KOD-Plus Plus-Ver.2 , @0 N/ ~, ]8 h* @: O! W4 V
KOD FX 3 g4 C3 W: d; T6 U2 q
高保真 PCR反应：- |( O. E, U) C
KOD DNA Polymerase
& }3 ?# O/ Y; q2 |KOD KOD-Plus Plus-
% B' C( M9 @! v1 B9 SKOD KOD-Plus Plus-Ver.2
! \7 }! }5 X9 G9 dKOD FX
: o* A9 `7 n1 t5 K% \+ n长片段 PCR反应：
( M( l6 \  X6 C( ]Blend Taq Taq
: ]4 l5 Y. U) `4 ]) {Blend Taq Taq-Plus Plus-
& \1 ~! D" h. T* U# |$ L  YKOD Dash
& I; G& t7 U& ^. {, y& CKOD FX

exin11

学习了