关于外周血干细胞分离实验几点疑问

duoduo777001

以下是我们在做外周血干细胞分离时候步骤，但实验效果不理想，望赐教！谢谢
% ~* `+ E: N0 A* y: [$ `1、取兔血30ml，平均分装在三个试管里。5 A5 R3 i) u  v8 w0 Q+ F0 U
2、取3个新试管，分别加入10ml的histopaque（1007+—0.001）
9 s) h- t! p6 a7 D; p/ n3、离心，400xg 1h
; s9 c% K6 H+ q' N4、离心后出现4层，提取出白色薄膜层。
) z% q, ~% q, P1 _6 ?- ^5、像提取的薄膜中加入5ml 1xpbs
( G" ]4 a0 k& i$ K* I6、250xg 10min 离心/ ~  s. K7 S1 G1 ?3 S' z+ ~# d
7、弃上清后加入3ml 1xpbs，离心，250xg 10min（重复2次）; o3 m9 G* S3 F- U" T
8、弃上清后，加入0.5ml1xpbs吹打，转移至dish中，最后再向培养皿中加入1.5ml的DMEM培养液（10%FBS 1%p/s），再于培养箱中培养。
' P. m3 P! P+ y! N* `0 T
7 t) t: A& j6 R8 a2 B4 f) S问题：1、在这个实验加入hispaque之前没有加入与血液等体积的PBS溶液，请问这个溶液加与不加都可以吗？3 w2 [7 G! z' I. Q: \7 R0 m' z1 E
      2、取白膜是十分困难，每次离心后看到的白膜基本处于透明色，且非常薄，十分不易提取，有没有什么好的办法可以建议一下，或者说实验步骤上有哪里需要改进。2 c/ }  r. l' X9 |' x; n  M' }
      3、对于第一次离心的时间上应该如何把握，与血液的量有什么样的关系，如果有，是怎么样的比例。
6 {' e8 x/ z* X$ @- v谢谢赐教！