关于脂肪细胞（附图）

duoduo777001

+ P6 {$ f# n* x. W* |/ B3 s/ O$ U' @. M% l6 {, Q# [
这段时间在同时做脂肪干细胞和外周血干细胞（兔），2个星期之前已经全部培养出，今天DAPI也以观察到。之前受到很多前辈的帮助，非常感谢，再此附上图片和各位分享一下。当然还有不足之处望指点。9 w* d7 ~" N$ m( T1 H& m! t
5 e8 z/ Q, G7 z* }+ v3 C
DAPI步骤：
3 Q& x1 `6 H0 z8 P1.细胞计数后，至于6well培养皿中培养，2天
% u7 X' `5 i7 _$ C. {/ j+ |2.去除用1ml/well 1XPBS washing 3times. 加入3.5%FPA 1ml/well 30min RT2 Z1 }5 n+ O9 l- t" Y  e. i
3.1XPBS washing 10min 2times.加入0.2%tritonX-100 1ml/well 15min RT
3 x) I8 j. z! b6 I4 P* p4.1XPBS washing 15min 3times.加入10ug/ml DAPI 1ml/well 15min RT
. @" Z" M# X, o5.1XPBS washing 2times.与显微镜下观察。
# `; e7 ~; O$ c0 p! g! S" }9 ~1 l7 v% j3 t' I
20x Auto( ^: u0 N( e$ e; n2 t  e9 J

  e* ^" r: A. v! U. e. I- M40Xmanual) M; y7 h! |& D

& A3 M: f6 L: Y
& }/ e, @; Y$ _* F2 v" p1 @兔外周血（耳背取血）
) h$ ]/ z; \- s. Z( z8 J& E6 x1 y: y20x Auto
9 P. d# v7 e5 \4 f! B& g  d* _/ d3 V. G' \" v; {! z, S
3 r% q4 I7 C5 d$ h  Y4 y! Y- R
40Xmanual
4 f, P& Q, J, E4 }; h$ Q! v

duoduo777001

前面两张是人体脂肪干细胞的，后面两张是兔外周血干细胞

cm11011

图片很漂亮，谢谢分享经验！

可怜的孩子

漂亮的工作，学习了。想请教一下兔外周血你一次取了多少ml，能不能附上外周血干细胞培养的简单的protocol，谢谢

yczmc1211

你好。结果很欣慰，想请教一下你是通过什么方法从众多细胞里分出干细胞的呢，能描述一下大概步骤吗？非常感谢！！！！

liulilin

请问 这是经过怎样处理之后？能在显微镜下看到这么漂亮的照片。

ambassador

这段时间在同时做脂肪干细胞和外周血干细胞（兔），2个星期之前已经全部培养出，今天DAPI也以观察到。之前受 ...7 H" X4 R& D+ T. C- O
duoduo777001 发表于 2010-4-22 19:16

4 i1 u! [2 ?% n# {
. U  p/ y& q$ S* b2 v, r; ^2 Q7 r
: m. D7 E  l4 M
    同问：你是如何从众多的细胞中分离出脂肪干细胞的呢？图片真的不错，是在荧光下拍摄的么？

haiyantang

非常漂亮，请问怎么分离的？

oldmac7

很受关注的课题, 以上所又的问题也是我想知道. 请楼主赐教.
# @3 I3 C- i+ [* T1 V8 u, k. M7 a请问如何培养人体脂肪干细胞和兔外周血干细胞?2 V# R. J6 h0 L. r4 R) H7 F6 ?
能不能把处理过程和PROTOCOL 贴上来?

duoduo777001

我也是在这里请教了前辈以后做出来的。因为自己也是初学者，所以只能附上比较粗略的步骤。有些地方也值得探讨。. J; {' \& o5 r( G3 \
兔（耳背）外周血干细胞" B; s! M+ K; ]2 V8 R
1、取血前3天分两次注入substanceP
( N" G' W& ^$ g2、一只兔取血10ML，立刻实验。
+ L* o4 r' l- ]' ^# c( {3、我们用的是Histopaque+—1077，与血液的体积比是1:1，血液在上，注意加入时尽量不要让其相融。. t5 M" @# {- P3 d: r# N
4、400xg 30min RT9 y1 l+ x# h% v. n
5、用pasteur pipet小心的取膜（约厚0.5cm），注意到新的tube中。( L6 H6 s$ k% |- \( j' `# S
6.加入10ml1XPBS，离心，250xg 10min。弃上清。
5 u2 ^- T- o7 @( n; A/ b7.在悬浮细胞，用5ml 1XPBS，离心，250xg 10min。弃上清（重复一次）
7 Y. e/ y- T8 b: F# K2 [8 Z! D1 I8.加入0.5ml 1XPBS轻轻吹打，转移到培养皿中，加入1.5mlDMEM(10%pbs 1%p/s)  b' V6 U$ h6 E! p3 x
大约要一段时间以后才能观察到。每三天换液一次。暂不传代。
6 O2 {. Q* {5 D3 v  s9 M
5 t6 p5 i2 U5 H# l" J! A; B9 c脂肪干细胞. Y1 j( g  M6 W0 `  K
取人体脂肪，经处理去除麻醉剂等物质$ ]- _6 s4 `' k* a( g& q0 E  N
1.配制collagense浓度为2mg/ml,1XPBS配制。与脂肪等体积混合. s' o# {7 L0 m$ o3 y" b
2.37℃，shaking，30分钟
! \, ~1 g5 P3 O; |% m3.过滤后，加入等体积DMED（10%PBS）。离心1800bpm 5min.弃上清
# [- P  V* f5 o* P# h$ o4.加入3mlDMEM,离心,3次
& R) Q1 ]9 [' L; }# [; E! C+ M3 S5.0.5ml 1XPBS混合，1.5mlDMED  （6well）
9 h7 j  x9 K( q: e' ^2 t/ e
3 ?. Z4 m* c  |; N荧光实验方法如上，蓝色显影的荧光剂，加了抗体以后会用绿色的。荧光显微镜是奥林巴斯X71
6 I# }" p' {7 F6 {7 }2 K7 y1 {+ L" d- a
还有不足请指教（加一句，个人觉得第1张和第四张很像阿凡达里面精灵树的感觉。。。。。。O(∩_∩)O~）