脐带间充质干细胞的分离培养

马锡慧

大家好，我想向大家请教一下：脐带间充质干细胞的分离有两种方法，组织块贴壁和酶消化法, ]; {3 K6 z; s4 m$ c
去血管和羊膜后，取华通氏胶剪碎后，若是组织块贴壁法，怎么操作才能使组织块很好贴壁呢？若是用胶原酶消化，是不是用胶原酶2啊？要消化多长时间为宜啊？具体的操作步骤是什么呢？

taoqilh

回复 1# 马锡慧 ) ~! o7 F# H& O  q
我们自己做的大多使用的是酶消化法，因为组织块贴壁法爬出来的细胞大多都是上皮细胞，在使用酶的时候，我们用的是1型胶原酶和透酶，

wuxiao101325

组织块没怎么做过，消化法可以参考：http://www.stemcell8.cn/thread-18220-1-1.html

taoqilh

至于消化时间，我们现在使用的是胶原酶和透酶消化一小时，完了再用胰酶消化半小时，

马锡慧

回复 2# taoqilh
- g; Y6 }, o, Y- Y
3 }9 t8 m: }- r
7 q- u1 L1 Z: J$ q   请问，你们的分离效果怎么样啊？
9 h# I$ z4 i, [/ |9 Y) X1 n6 V我只用胶原酶1消化的，可是细胞数太少了  ~% D, ?8 f) w0 Z( F
能发依一下你们的操作步骤吗 ？

wuxiao101325

忘了你不能下载：5 _$ L* B9 x$ j, |  j3 Y
脐带MSCs培养操作规程
# q7 I* e! k5 u! f1 无菌收集脐带，浸没于含1%双抗（青链霉素）的PBS中，玻璃容器密封送回实验室；
: l3 N' L) k1 m7 v2 超净台上剪取合适长度脐带，用PBS洗净血污；
2 t& K) r% g; l$ v5 M3 将脐带剪碎成肉糜状（2-3mm3），转移到100ml玻璃瓶中，每2cm脐带加入4ml的消化液（含0.25%胰酶，200~400U胶原酶Ⅱ/ml的PBS液），混匀，37℃摇床（150rpm）消化1小时；* V, R+ f+ F+ ]
4 将含组织块的消化液，转移到25cm2细胞培养瓶中，加入DMEM/F12(Gibco,cat no 12400-024)培养基（含15%胎牛血清Gibco, Ref 10099-141），37℃、5%CO2孵箱培养；; D  E. c# |/ `9 [2 R( |  Y
5 约三天左右能在显微镜下观察到贴壁细胞，首次换液时间为接种后24-48H之间，半量换液后继续培养，三天后换液，细胞已经能稳定生长。每三天换液一次，至细胞80%融合（约10天左右），即可进行传代；
/ j( |; j% ^$ u9 X0 O6 r5 x" W8 X6传代时去除培养基，用PBS洗涤贴壁细胞2次，加入1.5ml的消化液（含0.25%胰酶的PBS液），37℃条件下作用5-8min左右，加入等体积含血清的培养基中止消化，吸管轻吹贴壁细胞，使其从瓶壁上脱落下来形成细胞悬液；将细胞悬液转移到15 ml离心管中，800rpm离心5min，弃上清，用适量DMEM/F12培养基重悬细胞，进行活细胞计数并计算细胞活率，以适中浓度1000—5000个/cm2浓度进行铺板，置于37℃、5%CO2孵箱中培养。
& l2 h6 p4 X2 c* Z* U7 细胞冻存时，按传代的操作步骤获得细胞沉淀，用冻存液（30%FBS＋5%二甲基亚砜+DMEM/F12培养基）重悬细胞，调整细胞浓度为5×106/ ml左右，将细胞悬液转移到冻存管中，1ml/管，用程控降温仪降温后转移到液氮中冻存。

study

我做过组织块贴壁法的，细胞贴壁太慢了，大概14天左右才传代，还是用酶消化法能快一些

马锡慧

回复 7# study , T1 Z% v# i; m: V. c! W& p" S
  a5 _1 [5 O  `5 ?

6 c  ]) ^% Z' L4 |    请问你用的胶原酶几型啊？

xixitao

我用的2型胶原酶，文献上消化时间弹性很大，个人认为十小时左右，最好多观察消化状态

lchanlon

回复 9# xixitao 2 k6 U" {% r. k* i3 Q

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6 x& t1 T) H& N2 o    用4型的胶原酶做可以吗？