mES制备EB照片

yaoyaoyatou

大家好！第一次制备EB，感觉很失败，不知道原因在哪里？希望大家能给我指点一下。( @: M! e/ ~' L; R
我的EB培养基是：KO-DMEM, FBS,L-glu, NEAA, Pen-strep,meraptoethanol.9 O  ~; F% c. i! h. A$ Y
mES 的大概是10W/mL
' S/ k6 f$ X* @) }3 `- {! c方法一：20ul的小滴滴在皿盖上，倒扣在皿底，培养48hr， EB如照片所示，EB边界不清楚，形态不圆，分化严重。7 A4 J. r2 ]9 I0 H# @
方法二：将mES悬浮培养在细菌培养皿内，48hr后换液，EB状态同方法一差不多。
1 ]8 y6 q. [' X* B0 L* w请大家看看我的步骤有什么不妥的吗？给予指点。; r- D4 N4 R( ~' y

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yaoyaoyatou

补张照片1 O5 ]% \/ d5 m7 f$ `

痞子的烟头

作EB之前一定要保证MES或HES状态要好，至于培养基LIF以外，其它都成份都一样
- A" C; V1 k1 j: e# p, p还有消化作EB时，不要太过了，

xjya

对于方法一 ，悬滴法，细胞密度一般是20000-40000/ml.小鼠培养基一般20%FBS的高糖含L-glutamin的DMEM。48小时后收集EB的时候要特别小心，用蓝色枪头收集，注意不要反复吹打，以免打散EB。4 c$ W) d* X7 B
对于方法2，你是想用mass culture法吧。这个方法细胞密度一般是1000000/ml.但是要在摇床上不停的摇才行，48小时后稀释成1000个EB/皿，继续摇，直到相应的时间。
% t# J5 N5 ?) Q% ~# I2 D5 s2 ^从你的图中看，大概是吹的太狠了，EB都散架了。
' y3 k0 K* m+ G2 N9 B4 F还有一点我不明白，你觉得“EB边界不清楚，形态不圆，分化严重”，为什么说分化严重啊？好像这么说不妥~

wangzhuo822001

关注～～～

xiaojunhu1985

原因+ O1 |& O8 l1 \% w, K7 b! ~( J/ Q4 D
一：小鼠的ES 状态本身就不好。
5 i3 h7 @8 o# M二：做好不要用FBS 培养，很容易贴壁。要使用血清替代物。SR

xiaojunhu1985

这个问题我也遇过。尤其是在ES 状态不好的情况下

双刀

ES细胞的状态很重要，另外的就是，楼主用的FBS用的是哪个牌子的

wangzhuo822001

你说的方法二，是不是先由方法一悬滴培养两天，然后再悬浮培养？

yaoyaoyatou

方法二是直接将ES吹散后悬浮在分化培基里，在细菌培养皿里悬浮培养，48hr后EB很小。比方法一EB要小很多。至于mES状态还是不错的。但是很奇怪EB为什么总是这个状态。