MSC污染

aristolal23

先谢谢各位同学了，我的情况是这样的，自从6月份以来，每次取MSC的时候都会在不同的时间段出现细胞污染，有的是在原代就出现，有的是长到第一代，或者第二代，小弟非常困惑，希望能得到各位的指点。
4 {( {/ Q* ~% ?7 q3 A; N我取的过程大概是这样的。
: _* r; l( i7 D" _) e7 n! [1 SD大鼠3-4周处死，用乙醇（100%）的浸泡5-10分钟，然后拿到超净台去两个大腿，去皮，用PBS洗十遍，然后用纱布把肉撕掉，再用PBS洗10遍，然后取细胞，我一般取骨垢端以及大腿的骨髓，取完以后放入离心管，800转，8分钟，然后用培养液吹起来，放入六孔板中，一般一个大腿一个六孔板，然后72小时或者96小时以后换液，传代。
( n% c! V. Z  o& ]! A! [, B我所用的培养液是高糖DMEM,血清是GIBCO的，浓度是10%，加双抗。& {2 f/ V7 l$ j7 t2 L& H
请大家看看哪里出现问题了。

guosapphire

个人认为可将换液时间缩短一些，因为双抗只是抑制细菌的，时间长的话有些细菌就会产生抗药性，那就麻烦了。另外，建议原代的时候提高双抗的浓度。

franklinhg

乙醇75%试一试   PBS加2倍培养基中抗生素浓度  纱布不用  我一般是剪刀和镊子直接上 冲洗出来骨髓后 无菌筛网200目过滤后  离心1000g3分钟 25度  然后重悬 接种一般一只大鼠我接种一个T75 5-7天长的很好

franklinhg

培养基在加入10%血清和抗生素后 再次过滤 试一试

franklinhg

现在市面上的培养基假货很多

yuangaoqian

要说明一下出现的污染是什么污染，细胞污染可能是多方面的原因造成的，如人员操作、环境是否无菌、分离培养用具是否无菌以及培养基是否无菌等，而且污染也包括多种污染，如微生物、细菌、真菌、支原体、病毒等，有些是认为操作才能造成的，有些是血清等带有的，所以，最好说详细一点，最好附图。

deron

额，过程木有问题。应该与楼主操作或者培养箱有关吧。
* s, U! r1 A- f1 u4 F; |另外，为什么楼主用的是高糖的DMEM，高糖不是会导致MSC分化吗

aristolal23

个人认为可将换液时间缩短一些，因为双抗只是抑制细菌的，时间长的话有些细菌就会产生抗药性，那就麻烦了。 ...
, H# Z5 X, K, G6 Rguosapphire 发表于 2010-7-21 15:20

0 T8 Z, d  ]) z: o2 a3 e
, x3 R6 s: _- X) G; H7 X  a, K% n
谢谢你的建议- k+ R" r6 p7 Q
    如果换液的时间短了，细胞一般72小时以内细胞感觉帖不上

aristolal23

乙醇75%试一试   PBS加2倍培养基中抗生素浓度  纱布不用  我一般是剪刀和镊子直接上 冲洗出来骨髓后 无菌筛 ...$ A. P1 L: l9 \  d8 ]! a# a
franklinhg 发表于 2010-7-21 15:21

) l& G; \- `" n! T, }: t9 v& D
$ P; k" }+ z2 r% q3 Z" s$ \
5 X2 k5 [3 \! M: T8 H8 d& `    谢谢你的建议
/ L0 l* U0 Q2 s" }5 y0 R8 k   我下次试一试。我估计可能和纱布撕扯有关，即使纱布消毒了。

aristolal23

现在市面上的培养基假货很多
) E+ s  }! @% _+ X2 Zfranklinhg 发表于 2010-7-21 15:22

! W9 u) t/ K9 Q- [. B" L9 R" a# Y) j# \

9 e- E3 Y$ X3 t    我们经常通过这公司买，已经建立了很好的关系了，这个可以排除，呵呵。