u6启动子的问题

hndxws

最近做shRNA，用的是pBSU6质粒，接入shRNA时，采用的酶切位点是ApaI-gggcc/c。但在具体操作时，有的是用ApaI切过后，要把该位点变为顿末端，就是把ggcc去掉了，然后再连上shRNA，还有的是合成时直接合成了个粘末端的shRNA，直接连上去，这样两者的差别就是ApaI上的5个碱基ggccc。
* I9 S) @( ~! t" E( w. d有人说，U6启动时有固定的转录起始位点，就是ApaI的第二个G，这样好像第二种做法有点问题，不知到底是怎么样的？做过的同仁请给点意见，或提供点具体的操作资料。Thanks！

w20043459

膜拜各位大神

sarah19860420

回复 runsong 的帖子' g% s' l" i- [8 x0 W; S

& S  q0 }! |. y. `* @" h" |' C您好，我现在也是想用PLL3.7做shRNA。然后之前看帖子有的人说要形成这样的一个结构forward oligo：酶切位点+G+siRNA+loop+reverse compliment sequence+TTTTT9 u1 I$ o2 V# _8 s0 Z1 \- y
reverse oligo：酶切位点+AAAAA+reverse sequence+loop+compliment sequence +C5 F6 t) Q8 |; W; o) i& L9 M
& {9 p" O3 E5 e
我想问的就是这个G点就是你们所说的U6转录起点的问题吧。那如果siRNA这个核心结构的开头就是以G开头的，还需要加G吗，你们的转录起点问题怎么解决的。我的载体是PLL3.7，酶切位点是Xho I，NOT I。能不能给我点建议。实验室没人弄过。所以想得到一个确定的答案。

hughliang

回复 fguw 的帖子8 P$ H& z' [4 E" E/ f0 Q: F1 N

+ v# O& \2 t8 P% r7 e是的，偷懒没挑单克隆。
7 r, F% `! M; b5 m& j- }9 I4 `7 j5 N8 F6 W
我一般流式分选或G418筛选，但没挑单克隆。  h3 o# ~5 U6 c/ _) l1 E

8 k7 D& Y: t5 o流式检测时带荧光细胞比例最低时约70%多，可能对干扰效应有影响。
  R9 U1 x" I$ ^& O& b$ T2 v& \. u- V; u/ h! |- ]4 x
谢谢！

fguw

回复 hughliang 的帖子9 z( b% D+ r8 I' Z

5 y& K9 o4 w# c- Q; U7 @  f. _. M我觉得你做试验的细胞是多克隆？没有挑单克隆？
3 I& O6 N% ]8 U8 y; p流式证实转染细胞仍有荧光，大概阳性细胞比例多少？3 E; F, w# q$ F, a2 j+ n! Y
如果比例比较低，可能WB检测时更多的是非阳性细胞细胞（失活）信号。所以KD效果不好。
9 x; D$ Q0 M4 w4 l" }还有，SHRNA 和GFP使用不同的PROMTOERS，可能在不同的LOCUS活性不一样，当然，我不太认同该观点。

hughliang

runsong 发表于 2011-8-16 12:23 * S, Q5 U% ?) d, n6 u: F. m& j
回复 hughliang 的帖子
  ]: B* O; p# x, s8 G% z- u+ L8 U+ B# T$ s
十分感谢，你提供的线索太有价值了。

& N. r; P/ D, J# i. v1 _; g0 l9 k
不客气
! }3 _; Z* j; N) M2 G% b9 B/ a) t
也分享两篇供参考
' |) j8 m5 F8 j0 t) a$ x
9 K( e) }) x6 P祝实验顺利2 u  Y4 A. `  J$ w% L2 _& @
; R  O5 P- E: Q5 [! e* h9 o2 D# V

hughliang

fguw 发表于 2011-8-16 02:24 6 T2 S: \7 l8 }7 _* B1 c
回复 hughliang 的帖子
% t9 W6 b1 @) v8 |+ B- h
- O4 d3 a0 f( ?4 B  e) D8 @. r, O& C可能是长时间后慢病毒失活了，所以，不再有KD，

# d- z8 f6 J. q! X2 @
是有这个可能。# k: P- \- T- h' s3 N! k4 T

5 U1 r- |( [# ]但流式证实转染细胞仍有荧光，我在想是否细胞能补偿干扰的作用。

runsong

1 w5 M# F8 w+ ]2 B
, R# x( Y" @: k( s* J. U& I- H) Q回复 hughliang 的帖子! V' X3 Q0 M- D9 x- Z. G

' @2 ]- Y8 W; E$ Z十分感谢，你提供的线索太有价值了。
( A8 l& H& @# v6 l  \, H即pll3.7中7 s- p# K+ T- W) K% @/ P3 ~  ^
An HpaI site leaves a blunt end prior to the –1 position in the promoter. The oligo design must incorporate a 5’ T in order to reconstitute the –1 nucleotide of U6.
  \1 u0 u& E0 T1 d5 @引物设计应为 Sense oligo: 5’T-(GN18)-(TTCAAGAGA)-(81NC)-TTTTTTC4 p: u! N# h0 T
而且这个方法与一篇中文文章的做法一样。' ~: l% E1 S* d
《Cdx2基因RNA干扰慢病毒载体的构建与鉴定》（钱倩）

fguw

回复 hughliang 的帖子
  `4 h$ z) k& t  F' C+ Q0 A
# I' o! O$ ^, q7 \; I可能是长时间后慢病毒失活了，所以，不再有KD，" F1 i8 g: [/ C3 U6 M0 x
没有实验结果验证，猜的; ~8 q, n: E+ {4 Q) b% u
作普通转基因有类似问题，! l3 }# f: T. _. b1 R6 x4 o$ i/ V9 a$ t5 V
有问题，欢迎探讨

hughliang

% B1 ~$ U: c: L: N. }1 c% h. T, ^
+ I. w1 U1 @7 ~1 L; s$ _- M4 t
在这里遇见很多做慢病毒表达shRNA的朋友，向大家请教一个问题：
5 @$ J3 B7 G+ k' `( `" b4 |: z, U3 Q1 s6 @% P
表达shRNA的慢病毒转染细胞系细胞，流式分选带荧光的转染细胞，培养，western blot证实了干扰效应。$ `5 q0 Z! A3 O! e
, z2 _3 T' C! K8 Y
可是，培养数月后western发现干扰效应不再明显，甚至消失。在几株细胞系中都发现了类似情况。
( h( ~6 F! D) r# {$ S+ m9 u" r, |! n. B) L) |; R- r5 v
向大家请教原因和克服的办法，先谢！
6 c( j1 f- R& i. e8 s