饲养层细胞的制备

懵懂干细胞

今天杀了一只昆明白，取出了腹中7只小鼠，再去头、尾、四肢和内脏并取出每只小鼠的躯干表皮（鼠有点大，ribs长出来了）用于做饲养层细胞。* B: X" l$ M7 P1 i
我觉得在去头和四肢的时候用镊子直接夹着用剪刀剪比较快，如去四肢的话用镊子夹着四肢把小鼠稍微拉起就可以剪了。取表皮的时候可以不去内脏，
1 J; A, ^  |+ o& A直接剐皮比较方便，可以减少红细胞的产生。具体方法如下：! `2 S; P% j7 J! ?3 C* b2 H
（1）取孕12～l4d的昆明白母小鼠，脱颈椎处死后，用75％ 乙醇浸泡消毒。
! z% @8 i4 A/ T9 G（2）无菌条件下取出串珠状子宫，置入盛有PBS的平皿内，充分洗涤，去除血迹。0 |: d1 R) M' O
（3）剥开子宫，逐个取出胎鼠，用PBS液洗涤，去除血污。
/ X6 O7 l# C; ]* O& L2 J! W（4）去除胎鼠的头、尾、四肢和内脏，只留躯干，用PBS液洗涤，放入新的平皿中。
' ]' a" z! S& q& y6 f（5）用灭菌的眼科剪将躯干剪至1mm3（立方单位）大小，加入适量的0.25%胰酶，37℃ 下消化0.5小时。
5 l4 {- v8 n& C+ f0 |% I$ T（6）加适量含血清的DMEM培养基终止消化，100目筛网过滤。
6 Y8 r2 W# w/ w* d$ Y（7）将滤液吸至离心管中，2500r/min离心10min。2 Q' o2 E! q& u/ g
（8）弃上清（亦可再离心一次），用MEF培养液重悬细胞，调整细胞密度后放入T-75细胞培养瓶中。5 l( r1 F2 H/ Y) V8 j# W
（9）放入37℃，5%CO2，饱和湿度培养箱中培养。
; v6 a3 E' T1 E: E& Y（10）2-3天后，细胞基本长满时传代，记为第一代（P1）。& x& T; r% j) z0 ]' O# A
（11）细胞长至P2-P3代时，用于制作饲养层细胞。

yuhaoze

学习

songyang1987

谢谢分享

llecstem

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4 a; U% B7 k, {3 B. @$ @
' j* E9 n) C8 S$ U* m. a1 ?想问一下，用P3代的细胞制作MEF的时候，1*的细胞复苏到一个10cm的盘子，几天可以长满？

懵懂干细胞

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0 v  ]) l. y) l0 A+ w5 W- e7 b' P$ q( Z2 y& h4 x
这样的问题不好回答，要看你的细胞活性和冻存时候的细胞数目怎么样啊？; V% e9 o7 a9 V  d) }% }0 ^5 q( }9 W
复苏的操作等等都影响细胞复苏后生长的，复苏出来后你看一下细胞贴壁情况和细胞密度再自己
; Y) [' ~: V% \" X估算一下时间吧。

zdgrp

MEF用作饲养层细胞之前，还应该用丝裂霉素C处理，使细胞停止分裂吧？

mansnoopy

回复 zdgrp 的帖子2 G+ \( O2 i, C6 t6 T+ d8 c3 s
$ H- V% z% ~: v& p1 f
肯定是需要用的

mansnoopy

回复 llecstem 的帖子$ Q8 X( t6 d& F5 U. s2 S% q9 \
4 c  o: j" }. u3 c# \4 \' D
这个一般还是很快的 2-3天肯定可以

igdb

回复 懵懂干细胞 的帖子7 |8 @( r4 Q" p- b. b2 T4 ?7 g
/ Q0 Z# e+ W$ _# _: D- M
第一代不是应记做P0嘛？？

懵懂干细胞

回复 igdb 的帖子" p( ]% ]' p7 l" N

5 o8 O9 b# g% m3 e是的，大家都是记为P0代，谢谢提醒！！ 可能是我当时自己记为了P1代吧，不过也没关系的