饲养层细胞的制备

懵懂干细胞

今天杀了一只昆明白，取出了腹中7只小鼠，再去头、尾、四肢和内脏并取出每只小鼠的躯干表皮（鼠有点大，ribs长出来了）用于做饲养层细胞。
- j2 i' J# J7 \* Y/ f: q0 j$ H我觉得在去头和四肢的时候用镊子直接夹着用剪刀剪比较快，如去四肢的话用镊子夹着四肢把小鼠稍微拉起就可以剪了。取表皮的时候可以不去内脏，
" ^7 l; \; F/ Q5 r( K% U2 e  _! r直接剐皮比较方便，可以减少红细胞的产生。具体方法如下：$ c2 U$ H! {( W# S! o* c7 r( q7 }
（1）取孕12～l4d的昆明白母小鼠，脱颈椎处死后，用75％ 乙醇浸泡消毒。! k2 A, v, U- ?% _
（2）无菌条件下取出串珠状子宫，置入盛有PBS的平皿内，充分洗涤，去除血迹。5 U8 Z( N2 ]% L" m7 E2 i
（3）剥开子宫，逐个取出胎鼠，用PBS液洗涤，去除血污。
! z8 E8 N6 Q- v) w) A  v8 z（4）去除胎鼠的头、尾、四肢和内脏，只留躯干，用PBS液洗涤，放入新的平皿中。% \* A5 D+ l  b" T$ a4 G
（5）用灭菌的眼科剪将躯干剪至1mm3（立方单位）大小，加入适量的0.25%胰酶，37℃ 下消化0.5小时。  v% M6 h1 c! A: o( H' V8 o
（6）加适量含血清的DMEM培养基终止消化，100目筛网过滤。
4 a6 u1 D+ J8 S! k# I1 ~" X（7）将滤液吸至离心管中，2500r/min离心10min。
1 i# W6 ~- X9 _% {' x3 I- b（8）弃上清（亦可再离心一次），用MEF培养液重悬细胞，调整细胞密度后放入T-75细胞培养瓶中。
& v- S0 u4 P) b: m（9）放入37℃，5%CO2，饱和湿度培养箱中培养。
- e- I& S6 @( f) Q% n3 ^, M7 F（10）2-3天后，细胞基本长满时传代，记为第一代（P1）。1 ~; I( K, }7 I1 i# t
（11）细胞长至P2-P3代时，用于制作饲养层细胞。

第一心音

筛网是什么样的啊，谢谢

igdb

回复 懵懂干细胞 的帖子* A- r$ d$ |7 l2 [( H7 M3 j4 m2 x

! q( C. k6 K1 B" M0 o& W0 ~& E嗯，叫法没关系。。大家别混淆就好

懵懂干细胞

回复 igdb 的帖子
# R5 r) O/ y5 W& f+ I- u4 w
- f6 {0 ^/ Y  J( u; M- w是的，大家都是记为P0代，谢谢提醒！！ 可能是我当时自己记为了P1代吧，不过也没关系的

igdb

回复 懵懂干细胞 的帖子
9 s! c& f, o( K% d: `) R& c+ j0 v1 b4 G3 z) L9 m) L# G
第一代不是应记做P0嘛？？

mansnoopy

回复 llecstem 的帖子# T! R# G& t  E

  C* i5 A/ F# [: R  _' K这个一般还是很快的 2-3天肯定可以

mansnoopy

回复 zdgrp 的帖子
) X% @2 [. t! [  ?7 D+ n+ I
: K4 F0 ~( C1 m. }肯定是需要用的

zdgrp

MEF用作饲养层细胞之前，还应该用丝裂霉素C处理，使细胞停止分裂吧？

懵懂干细胞

回复 llecstem 的帖子  b* S9 @# t! V( C: a
: ~! C$ ~; l( }5 ~
这样的问题不好回答，要看你的细胞活性和冻存时候的细胞数目怎么样啊？: b7 {' Q2 F% p5 M: T
复苏的操作等等都影响细胞复苏后生长的，复苏出来后你看一下细胞贴壁情况和细胞密度再自己
, |: x  h0 ?  C# h. E# |估算一下时间吧。

llecstem

回复 懵懂干细胞 的帖子
& @' f. t9 f" D9 Y& c% J. A  I8 u/ a( W: x" a4 O* z8 J: }
想问一下，用P3代的细胞制作MEF的时候，1*的细胞复苏到一个10cm的盘子，几天可以长满？