饲养层细胞的制备

懵懂干细胞

今天杀了一只昆明白，取出了腹中7只小鼠，再去头、尾、四肢和内脏并取出每只小鼠的躯干表皮（鼠有点大，ribs长出来了）用于做饲养层细胞。
0 U; J9 ~- ]8 }  I我觉得在去头和四肢的时候用镊子直接夹着用剪刀剪比较快，如去四肢的话用镊子夹着四肢把小鼠稍微拉起就可以剪了。取表皮的时候可以不去内脏，; l( }5 s% K! F+ n$ \4 ^' C
直接剐皮比较方便，可以减少红细胞的产生。具体方法如下：
# _8 S$ {4 g' E2 c1 ?- }（1）取孕12～l4d的昆明白母小鼠，脱颈椎处死后，用75％ 乙醇浸泡消毒。) R6 y# r7 g+ P3 V% c2 s+ Z) i
（2）无菌条件下取出串珠状子宫，置入盛有PBS的平皿内，充分洗涤，去除血迹。
/ t8 i: l2 k1 Z7 j7 x3 L! `（3）剥开子宫，逐个取出胎鼠，用PBS液洗涤，去除血污。
7 s: U: d7 o1 g$ A" Z: U3 e（4）去除胎鼠的头、尾、四肢和内脏，只留躯干，用PBS液洗涤，放入新的平皿中。# P1 j: D, @$ ]) Z
（5）用灭菌的眼科剪将躯干剪至1mm3（立方单位）大小，加入适量的0.25%胰酶，37℃ 下消化0.5小时。
' k7 @3 s# C8 l3 q5 D% k8 {（6）加适量含血清的DMEM培养基终止消化，100目筛网过滤。
+ V7 D6 C2 L. E（7）将滤液吸至离心管中，2500r/min离心10min。
  O% w% \6 h3 W2 H; G0 F（8）弃上清（亦可再离心一次），用MEF培养液重悬细胞，调整细胞密度后放入T-75细胞培养瓶中。
: L! I; k4 Z' a（9）放入37℃，5%CO2，饱和湿度培养箱中培养。! N5 p' s7 u$ Q9 E( v# [
（10）2-3天后，细胞基本长满时传代，记为第一代（P1）。% m- m( V3 l- p, o
（11）细胞长至P2-P3代时，用于制作饲养层细胞。

yuhaoze

学习

songyang1987

谢谢分享

llecstem

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4 s! ]- U# h5 b& J# G3 ]
想问一下，用P3代的细胞制作MEF的时候，1*的细胞复苏到一个10cm的盘子，几天可以长满？

懵懂干细胞

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6 B* \4 ^& m. b) S/ \
9 B0 B( ?* l. N" c) Z这样的问题不好回答，要看你的细胞活性和冻存时候的细胞数目怎么样啊？
1 X+ R" O7 Z5 ?, V9 N' p复苏的操作等等都影响细胞复苏后生长的，复苏出来后你看一下细胞贴壁情况和细胞密度再自己
- N+ T" |% X& f' @3 {& |估算一下时间吧。

zdgrp

MEF用作饲养层细胞之前，还应该用丝裂霉素C处理，使细胞停止分裂吧？

mansnoopy

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  w$ }5 u8 p4 X3 S
2 o- W" j: a4 v0 b3 U# o" \$ ]肯定是需要用的

mansnoopy

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! W/ Z5 z# V  M% U# c$ i
) e5 ^3 f; }, g. _! ?* }7 B这个一般还是很快的 2-3天肯定可以

igdb

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- w7 _, _$ f& b& g5 R
( R) g0 X- `7 Q( v0 ?第一代不是应记做P0嘛？？

懵懂干细胞

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( c$ c9 B" Q& w' ~9 ~" M8 F0 Z4 u& l* g3 B/ w$ v7 r6 Z
是的，大家都是记为P0代，谢谢提醒！！ 可能是我当时自己记为了P1代吧，不过也没关系的