饲养层细胞的制备

懵懂干细胞

今天杀了一只昆明白，取出了腹中7只小鼠，再去头、尾、四肢和内脏并取出每只小鼠的躯干表皮（鼠有点大，ribs长出来了）用于做饲养层细胞。+ Z- e$ z& E8 _. x( j6 d, f/ A
我觉得在去头和四肢的时候用镊子直接夹着用剪刀剪比较快，如去四肢的话用镊子夹着四肢把小鼠稍微拉起就可以剪了。取表皮的时候可以不去内脏，
. g1 L; U4 g; m+ ^2 ?7 j2 m. ]# Z直接剐皮比较方便，可以减少红细胞的产生。具体方法如下：
! v$ f  f  ^  p; \6 P（1）取孕12～l4d的昆明白母小鼠，脱颈椎处死后，用75％ 乙醇浸泡消毒。# e5 c2 L4 N7 Y
（2）无菌条件下取出串珠状子宫，置入盛有PBS的平皿内，充分洗涤，去除血迹。
% e/ ]! I3 I+ o8 e+ z3 \: {（3）剥开子宫，逐个取出胎鼠，用PBS液洗涤，去除血污。% B* Q3 n" ]9 ?0 X7 B9 A  A/ s& R
（4）去除胎鼠的头、尾、四肢和内脏，只留躯干，用PBS液洗涤，放入新的平皿中。
9 ^! `4 Z' {+ l+ y（5）用灭菌的眼科剪将躯干剪至1mm3（立方单位）大小，加入适量的0.25%胰酶，37℃ 下消化0.5小时。
7 h5 t# N1 m: j$ w6 G: D4 a（6）加适量含血清的DMEM培养基终止消化，100目筛网过滤。
% b& s+ X" J- q4 T3 `7 }) N9 W（7）将滤液吸至离心管中，2500r/min离心10min。
. {+ R0 N3 r1 F4 ~: c（8）弃上清（亦可再离心一次），用MEF培养液重悬细胞，调整细胞密度后放入T-75细胞培养瓶中。
" j# Q# \) \: r7 I$ p' O0 x（9）放入37℃，5%CO2，饱和湿度培养箱中培养。
. B9 Z8 X# F  v! N& n+ V; D（10）2-3天后，细胞基本长满时传代，记为第一代（P1）。) P* E7 T) F8 W& [
（11）细胞长至P2-P3代时，用于制作饲养层细胞。

yuhaoze

学习

songyang1987

谢谢分享

llecstem

回复 懵懂干细胞 的帖子! E+ Z4 F$ J9 E2 Q8 g& J2 ~5 M

4 l& V3 p4 k8 l' a; x/ h6 w& q想问一下，用P3代的细胞制作MEF的时候，1*的细胞复苏到一个10cm的盘子，几天可以长满？

懵懂干细胞

回复 llecstem 的帖子3 V, ]2 [8 x2 C4 F7 d: s# g2 o' D/ g

% n$ X% e* B* \7 h这样的问题不好回答，要看你的细胞活性和冻存时候的细胞数目怎么样啊？
( a7 q7 ~( G" E8 E3 E7 D( X. r' R复苏的操作等等都影响细胞复苏后生长的，复苏出来后你看一下细胞贴壁情况和细胞密度再自己
( A0 ]$ X4 h& W) Q1 g估算一下时间吧。

zdgrp

MEF用作饲养层细胞之前，还应该用丝裂霉素C处理，使细胞停止分裂吧？

mansnoopy

回复 zdgrp 的帖子
; W! Q" o& ?4 C" f, P8 ]9 e7 c% e8 i* D- E
肯定是需要用的

mansnoopy

回复 llecstem 的帖子& U/ M8 p9 l3 I6 z4 @& e

# {) X4 U% D! T这个一般还是很快的 2-3天肯定可以

igdb

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5 Q5 Z* d. f/ X9 U
$ P0 M! q5 c6 X! Z第一代不是应记做P0嘛？？

懵懂干细胞

回复 igdb 的帖子, Z) X  `9 i1 E9 t0 v; r; F6 u
2 n: |* k6 P; f0 P" g
是的，大家都是记为P0代，谢谢提醒！！ 可能是我当时自己记为了P1代吧，不过也没关系的