奇怪，神经干细胞消化后传代后细胞都消失了？（附图）

xfyang2007123

% d' i, q+ j2 c- _# j

; a3 d# i) t; y昨天给原代的神经干细胞传代（是第十天的原代细胞），传代前干细胞球还是挺好的。但是我用0.25%的胰酶消化成单细胞再过两天就什么细胞都没了，不知什么原因？请各位帮帮忙看看。我的胰酶是配好2月在-20℃冰箱里存放的。传代方法是：1。将培养瓶中的悬浮细胞及培养液吸入离心管1000转每分中离心5分钟。2。经上清液的一半加入新的培养瓶中（半量换液），其余的上清液吸掉，在沉淀中加入胰酶混匀，边用吸管吹打，约十分钟。3。再离心1000转每分 5分钟。4。吸掉上清液，加入新鲜培养基混匀后转入培养瓶中。因为怕用血清终止消化的话已引起神经干细胞分化，所以没用血清终止消化。不知道为什么到第二天一看，什么细胞都没有了，只有些细胞碎片。
) }+ r# d" w/ `7 f( y. q这是传代前的神经干细胞球，大家看看应该没什么问题吧？

ouyangjuan

我是直接离心，再用0.05%的胰酶37°消化十分钟，再轻柔的吹打数十下，再用sigma的trpsin inhibitor终止消化，最后离心去掉胰酶，传代培养就一直能养下来！

crystal20101026

离心的速度可以降低点，我用的是800转/分，3min，就可以了。而且我觉得还是应该终止消化。神经球的密度还是比较大的，一般这种速度就可以了。这样养出来的细胞比较好看。

xfyang2007123

回复 40# dingyx2009 & D& a; j& Q4 B0 `( W) I9 `2 q
谢谢关注！那么请问你们用的胰酶/EDTA浓度是多少?我试过0.1%的胰酶基本可以达到目的。但是还是感觉对细胞破坏挺大的。

dingyx2009

回复 9# xfyang2007123 . v' b, i) A- @: L
4 O/ o* w+ z% H
如果是想半量换液，将含细胞的培养基离心后，上清全部取出后，在种细胞加入一半新鲜培养基一半旧的即可。

dingyx2009

最关键的一点绝对不能在胰酶中吹打细胞的。只有细胞碎片就是这个原因。
. W8 Z  ?6 Y# U: B我一般把含细胞的培养基取出，离心1000转5分钟，完全弃上清，加入胰酶加EDTA消化，孵箱孵育30分钟，每隔10分钟左右可取出震荡摇匀。10％的胎牛血清终止消化，1000r/5min,弃上清，培养基漂洗2次，再加入干细胞的培养基吹打15次左右，基本都是单细胞，分瓶培养。" M! f, |! [, ?- D' t
一直效果很好的。至于那一点残留的血清，根本达不到干细胞分化的程度。

xfyang2007123

回复 38# tieyun 7 w+ V  ^2 J4 g8 ~4 ~% b6 Q
我用0.125%的胰酶消化加吹打也吹打不开呢，仍在一团。所以换了accutase试试。

tieyun

是鼠的神经干吗？建议改用0.05%胰酶加吹打消化，时间不要超过2分钟。可以用10%血清终止，再用培养液洗一次细胞团就好。

qiuweiqin0618

回复 25# SVZ 0 {4 z* b9 ]+ r3 _9 ~9 c1 ~2 O

2 n' k. m: e% s. }; t0 N
! g, ?) I2 S) v( u; v; ?7 F    赞同你的观点

xfyang2007123

回复 35# jennyshy : _. A; Y  C6 d; G/ |/ C
& K" |6 R+ S% M0 z6 j6 e- A' Z7 ?
Thank you!