求助：有没有人做过鸡胚成纤维细胞的培养，求经验

honeyliubei

我第一次做这个培养，想求点经验。谢谢各位了

coralqin

在2001年刚进实验室的时候几乎每天做这个实验，翻出以前的实验记录，整理了下，希望对你有用：
4 L% f. R/ Q+ ~$ f6 H8 o鸡胚胎成纤维细胞的制备5 r8 u' w, t, E% A) H
1. 取9～10日龄的鸡胚，用碘酒和酒精消毒，在超净工作台内，小心取出鸡胚，放在无菌培养皿中，除去头部、翅膀及内脏；
7 g1 q; a  \( G) G1 z+ n& |: h( m2. 胚体用PBS冲洗2～3次，切成1～2mm3的小块，然后转入容积适量大小的三角瓶内；" s( S) v8 \1 A( _- I! @
3. 按每个鸡胚加入15mL的EDTA-胰酶消化液，在室温下消化6～8 min；2 V8 [$ @  N/ H
4. 小牛血清终止消化，收集细胞悬液，没有消化完全的组织块可再消化一次；
$ V0 }  ^8 I' a+ Y! e  w5. 收集到的细胞悬液经100目过滤筛过滤，180g离心5 min，去上清；& T& ], U: j9 `2 n
6. 细胞沉淀用DMEM培养液重新悬浮，取出少量细胞悬液台盼蓝染色，计算细胞活力；1 Q4 n' M6 N/ T$ ~( _( W
7. 以5×105个/mL的密度接种到培养瓶中，于38.5℃、5%CO2浓度、饱和湿度条件下培养。
  y. t/ M5 b5 s8 @鸡胚胎成纤维细胞的传代5 n: C& {" ~! G, K1 W
1. 原代培养的细胞铺满培养瓶底部时，即可进行传代；$ f. v2 h3 C  q% Z
2. 吸出原培养液，然后用PBS清洗细胞2～3次，尽量除去残余的血清；
0 }) ]  U3 n6 [) U4 c  b3. 加入0.2 mL的EDTA-胰酶消化液进行消化，消化程度可在倒置显微镜下观察，一般以细胞突起缩回、细胞间间隙增大、细胞近乎缩成圆形为度，终止消化。
: }2 {! u% }4 u% n! _7 e6 J4. 吸出消化液，加入适量的含小牛血清的培养液，反复轻轻吹打培养瓶底部，使经消化的细胞脱离瓶底并分散为单个细胞；6 |$ M& }# ~! p! j8 F5 g
5. 收集细胞悬液，180g离心5min，去上清；
- r- R+ a! @3 t6. 用培养液重新悬浮细胞并计算细胞活力和密度，以5×105个/mL密度接种到培养瓶中，于37.5℃、5%CO2浓度、饱和湿度条件下培养。

coralqin

如果你打算用鸡成纤维细胞作为feeder, 建议选取3代左右的，细胞纯度高，分泌的细胞因子也足。
! V1 b6 C) h2 }- v- P饲养层细胞的制备
; \, A$ c* d% u" y: w* C' B1. 选取生长良好、传至第2～3代的成纤维细胞，吸出原培养液，换成含有10µg/ml丝裂霉素-C的培养液，在培养箱中作用2.5 h；
: W# o$ K* Z9 J6 q% i! r4 l+ R2. 吸出含丝裂霉素-C的培养液，用PBS洗涤饲养层细胞7～8次；' V3 I4 D  M! z0 ]  v( ]
3. 加入0.2 mL的消化液进行消化，消化程度可在倒置显微镜下观察，一般以细胞突起缩回、细胞间间隙增大、细胞近乎缩成圆形为度；
1 ?. [- A6 y5 I0 K4. 吸出消化液，加入适量的含小牛血清的培养液，反复轻轻吹打培养瓶底部，使经消化的细胞脱离瓶底并分散为单个细胞；
( B0 @3 d2 ^( f0 \$ w5. 收集细胞悬液，180g离心5min，去上清；
" A* ?3 t. i5 C7 g' _0 V) W6. 用培养液重新悬浮细胞并计算细胞活力和密度，以1×106个/mL密度接种到培养板中，于37.5℃、5%CO2浓度、饱和湿度条件下培养；
4 o, b. a4 v- e0 B5 M7. 待细胞贴壁后进行观察。如果细胞过稀，须补加处理过的细胞，以保证细胞连成一片；4 B% W: h. G- `* N+ D- _
8. 制备好的饲养层细胞放在培养箱中备用。5 d内使用。