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本帖最后由 细胞海洋 于 2011-2-15 23:31 编辑
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+ R- l8 b9 Y2 j9 b M; _+ x. K s7 J& r1 L7 C5 i
培养条件
+ k8 i, i5 M8 }% t- b, L, x, u% J环境：细胞培养需要一个无菌的环境，所以尽量是在一个独立的房间里进行。要求配有空气净化系统，能够对整个房间进行杀菌的紫外灯。 3 }* Z/ O V& Z) h
设备：二氧化碳培养箱、超净工作台、倒置显微镜、冰箱、水浴锅、离心机、实验桌、移液器等。
4 }) Q5 z, Q# c7 y; }+ U实验耗材：一次性的细胞培养皿或细胞培养瓶、15ml或50ml离心管、脱脂棉花、封口膜等。
! ] o2 Y+ \2 x/ L/ V2 |: R4 i试剂：干细胞对培养条件要求较高，可以根据自己的条件，尽量选用质量好的各种试剂。
2 S; `# B% d w( ] k! c$ Y试剂的配制：
! i5 t W" X+ p1 y8 CDMEM培养基: 去离子水中含1.34% DMEM粉末、0.22%NaHCO3
$ T+ J0 v$ c7 S1 H. UMEF培养基：DMEM培养基中含10%FBS, 1000u/ml 青霉素, 1000g/ml 链霉素 : }1 e6 x8 ?- P. w3 k# M: O/ Q
ES培养基: ES培养基：DMEM培养基中含15% FBS，1×106 U青霉素，1×106 g链霉素，1mM丙酮酸钠, 0.1mM 非必须氨基酸, 2mM 谷氨酰胺, 0.1mM 巯基乙醇, 1000u/ml 白血病抑制因子
; g/ J2 F4 K" d$ J( t/ eD-Hank's： 0.8%NaCl, 0.04%KCl, 0.035%NaHCO3, 0.006%KH2PO4, 0.005325%Na2HPO4, 0.001%酚红
. d4 q0 W5 j! ?7 p0.1%明胶: D-Hank’s溶液中含0.1%的明胶
8 e m- q. u* M* M( n! X5 f! pES细胞冻存液：90% ES培养基，10% DMSO
% t3 F+ z/ \, f* T" iMEF细胞冻存液：90% MEF培养基，10% DMSO ) M7 r5 t- y" o" j, G+ X* a
Feeder细胞冻存液：90% FBS ，10% DMSO 8 {: t7 }/ P0 U& T2 {" {
丝裂霉素C: 根据产品说明书来配制 ! u6 j8 Y: M, _1 }0 r
培养步骤 ' V0 G5 Z+ R8 ?8 x9 I- Z8 Q
常见的干细胞培养是胚胎干细胞（ES cells）培养。我们以小鼠的胚胎干细胞培养为例。 . v* T% j4 ^% F* n* a
; B9 N2 S& b2 j% Y, w& O小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblasts，MEF）的复苏 t ^ f# U& _6 v$ d2 M0 g
胚胎干细胞一般是在37℃、5%CO2和95%湿度的培养条件下，生长在铺有一层滋养细胞层的细胞培养皿或者是细胞培养瓶中（此处以细胞培养皿为例）。因此要先铺滋养层细胞。
1 t! S$ y1 \. {7 y4 N" J; M6 D
5 b2 d- N* u4 Y: ]( w在37℃水浴锅里快速融化一管液氮冻存的小鼠胚胎成纤维细胞。 + I. g; k6 c6 Z
把融化的细胞悬浮液加到装有几毫升预热好的MEF培养基的无菌离心管中，轻轻混匀后，1000×g ，5min离心收集细胞。
) k) _' T; \4 D% z6 ?1 i, P7 b吸掉上清（除去冻存液中的DMSO），用10ml预热的MEF培养基重悬细胞后，加到一个10cm的细胞培养皿中，放入37℃，含有5%CO2的加湿培养箱中培养。
; o6 |- T3 w& D1 M根据情况对细胞进行换液，大约4天左右，细胞就可以基本长满整个培养皿，这时可以进行传代、冻存或用于制备滋养细胞层。
) x$ ~% |; T7 i. h/ y! S滋养细胞层（feeder cells layer）的制备 , v B; h% r {5 B. y; |# [6 f
把长好的小鼠胚胎成纤维细胞的培养基吸掉，加入10ml新鲜的MEF培养基，并在避光的条件下加入110μl配好的丝裂霉素C，混匀后放入培养箱培养2h。 0 w$ ^" s9 H9 v M6 a2 U
把含有丝裂霉素C的培养基用无菌的15ml离心管收集起来避光保存，在一周之内可再次使用（直接使用该培养基处理细胞5h）。用PBS(不含二价离子)洗涤细胞2到3次后，用1ml含有EDTA的胰酶消化细胞，37℃培养箱放置约3min，直到细胞悬浮起来。
# t* ?: P: l+ B用1ml MEF培养基中和胰酶的作用，之后把细胞收集到离心管里，1000×g离心5min。 ! @1 h) u! T( i6 v0 e! M; E# ?
去掉上清，用1ml MEF培养基重悬细胞，之后把细胞平均分到两个经过0.1%明胶处理过的细胞培养皿中，用MEF培养基培养细胞。（明胶处理：加5ml 0.1%的明胶到细胞培养皿中，在37℃培养箱中至少放置10min，之后把明胶吸掉即可） : Q! _7 n h* c$ q+ O
一般处理好的小鼠胚胎成纤维细胞在1~2h之后即可以贴壁，形成滋养细胞层，这时的滋养细胞层即可用来培养小鼠胚胎干细胞。制备好的滋养细胞层可以在MEF培养基中保持1周左右的时间，或者是把细胞冻存。
- r5 |2 K. ^* n; X( y小鼠胚胎干细胞（mouse embryonic stem cells，ES cells）的复苏
- [2 ?2 m% ~0 L/ \7 O在37℃水浴锅里快速融化一管液氮冻存的小鼠胚胎干细胞。
2 L& S, m' I) E2 [- o& O W把融化的细胞悬浮液加到装有几毫升预热好的ES培养基的无菌离心管中，轻轻混匀后，1000×g ，5min离心收集细胞。 2 a& ~5 P5 |7 R' d
吸掉上清（除去冻存液中的DMSO，用10ml预热的ES培养基重悬细胞后，加到一个10cm的铺有滋养细胞层的细胞培养皿中，放入37℃，含有5%CO2的加湿培养箱中培养。
' B7 h% K/ C0 D5 }6 x根据情况对细胞进行换液，大约3~4天左右，细胞就可以基本长满整个培养皿，这时可以进行传代、冻存或用于后续试验。
% v2 S2 r9 H, q# ~+ w. W) p小鼠胚胎干细胞的传代
) U7 y& g- J, s8 i* K吸掉培养基，用PBS(不含二价离子)洗2~3次后，加1ml含有EDTA的胰酶消化细胞，37℃培养箱放置约5min，直到细胞基本悬浮起来。 `# Z7 [" h. e3 J
用1ml ES培养基中和胰酶的作用，之后把细胞收集到离心管里，1000×g离心5min。 4 A' W) |) ]$ M& D, p' |) T5 w
去掉上清，用几毫升ES培养基重悬细胞，之后根据培养皿规格和分配比，把细胞按一定比例分到铺有滋养细胞层的细胞培养皿中，加ES培养基培养。ES细胞的分配比可以是1:1到1:10。
) ~1 k' C# d0 a& `$ ~6 S8 h. u2 ?小鼠胚胎干细胞的冻存
( u( \- }, Y3 U- [' R吸掉培养基，用PBS(不含二价离子)洗2~3次后，加1ml含有EDTA的胰酶消化细胞，37℃培养箱放置约5min，直到细胞基本悬浮起来。 & M7 V j! b6 W+ S4 l# n. O8 t
用1ml ES培养基中和胰酶的作用，之后把细胞收集到离心管里，1000×g离心5min。 + y4 S2 b' H4 z( H' Z/ v) L
去掉上清，用预先配制好的预冷的ES细胞冻存液来重悬细胞（冻存液的量视冻存的细胞量来定，一般一个长满的10cm细胞培养皿可以冻存4~6管），按每管1ml的量分装到冻存管中。梯度降温：4℃20min，-20℃20min，-80℃过夜后迅速转入液氮中。 ; c. k$ u# y7 r0 i5 ~) l
注意事项
8 |4 J+ b& G% Y9 E" o# Y丝裂霉素C在操作时要避光，避免其分解。
3 C1 R9 S5 {- UES细胞倾向于聚集生长，因此在复苏时，要选择好培养皿的规格
0 o1 g2 s* L+ z9 l& s8 fES细胞不能长的太满，应避免使各个克隆之间接触，以免发上分化。
6 w5 T3 y/ |. r. g) [5 {: S- U为避免水或血清带来的污染，对血清应进行支原体检测，配好的培养基要进行污染测试。 |
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发表于 2010-12-15 10:00
发表于 2010-12-15 11:13
