求助胚胎干细胞培养方法

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先谢谢各位战友了，谁能帮我介绍一些培养方法，大概流程，多多益善、再次感谢

细胞海洋

本板块有很多 先自己搜索一下

随风的天使

说的详细点， 每种胚胎干细胞的培养方法都不同，的依情况而定。

cailand

人的还是鼠的，或是其他物种的？

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人的ES和胎儿成体干细胞，谢谢，请指教。

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回复 cailand 的帖子% v9 ^7 p2 J& {( d$ b

0 O+ Y' D1 B8 F' w人的ES和胎儿成体干细胞，谢谢，请指教

cony

论坛已经有很多了，自己先找找看，

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谢谢大家的建议，都找过了，没有很完整的，而且都是一些冻存方法、请各位继续指点。

syl82

  j/ A' n1 o' Z+ Z) k  L, @% X) f. ~3 ?
# C6 u$ x0 Q9 ^0 C+ Q3 F4 C- B
培养条件
; K  t3 {% E* |6 [. x环境：细胞培养需要一个无菌的环境，所以尽量是在一个独立的房间里进行。要求配有空气净化系统，能够对整个房间进行杀菌的紫外灯。
6 V- ]6 v! P5 Y设备：二氧化碳培养箱、超净工作台、倒置显微镜、冰箱、水浴锅、离心机、实验桌、移液器等。
- }: p2 N* p+ |+ F* ^) x实验耗材：一次性的细胞培养皿或细胞培养瓶、15ml或50ml离心管、脱脂棉花、封口膜等。 / z5 }' d0 W+ q0 W
试剂：干细胞对培养条件要求较高，可以根据自己的条件，尽量选用质量好的各种试剂。 8 t+ u7 _0 ~5 V7 B+ `/ L$ n
试剂的配制：
2 A% D1 N* b7 e  FDMEM培养基: 去离子水中含1.34% DMEM粉末、0.22%NaHCO3
1 v. U4 @9 W0 ^- v& kMEF培养基：DMEM培养基中含10%FBS, 1000u/ml 青霉素, 1000g/ml 链霉素 8 H9 l% T/ W& S
ES培养基: ES培养基：DMEM培养基中含15% FBS，1×106 U青霉素，1×106 g链霉素，1mM丙酮酸钠, 0.1mM 非必须氨基酸, 2mM 谷氨酰胺, 0.1mM 巯基乙醇, 1000u/ml 白血病抑制因子 - J5 v& W! N  i/ {; j, a
D-Hank's： 0.8%NaCl, 0.04%KCl, 0.035%NaHCO3, 0.006%KH2PO4, 0.005325%Na2HPO4, 0.001%酚红
" C8 b+ t8 D2 _' Y0.1%明胶: D-Hank’s溶液中含0.1%的明胶 % e3 e# C5 M1 J9 U+ Q# v) k
ES细胞冻存液：90% ES培养基，10% DMSO
$ k, U# b5 `8 Z. Q3 D3 r+ s& `7 ZMEF细胞冻存液：90% MEF培养基，10% DMSO ; J$ v/ u1 k  i
Feeder细胞冻存液：90% FBS ，10% DMSO
: N8 T. ^; P, x7 G  o丝裂霉素C: 根据产品说明书来配制 ! f. `  M/ o! r/ _3 D% {, ~+ X7 s
培养步骤 & ~# Y9 [: I/ a) T) b
常见的干细胞培养是胚胎干细胞（ES cells）培养。我们以小鼠的胚胎干细胞培养为例。
6 ]1 |3 e! S# E7 j# p6 T/ a
2 o2 {. i) c1 i5 G; A* y小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblasts，MEF）的复苏
8 G  T" x) ~8 k6 y; ~( p+ p胚胎干细胞一般是在37℃、5%CO2和95%湿度的培养条件下，生长在铺有一层滋养细胞层的细胞培养皿或者是细胞培养瓶中（此处以细胞培养皿为例）。因此要先铺滋养层细胞。
! _- d- ~5 U' Q7 X! ~$ h( ^; _* v6 B, ?
在37℃水浴锅里快速融化一管液氮冻存的小鼠胚胎成纤维细胞。 5 P$ I" t4 }  v, f7 K6 g2 M
把融化的细胞悬浮液加到装有几毫升预热好的MEF培养基的无菌离心管中，轻轻混匀后，1000×g ，5min离心收集细胞。
8 f0 l- m- k  @. u! i; e5 U9 J吸掉上清（除去冻存液中的DMSO），用10ml预热的MEF培养基重悬细胞后，加到一个10cm的细胞培养皿中，放入37℃，含有5%CO2的加湿培养箱中培养。
" J4 `3 Q! W5 j- }& K1 O根据情况对细胞进行换液，大约4天左右，细胞就可以基本长满整个培养皿，这时可以进行传代、冻存或用于制备滋养细胞层。
1 w0 D3 B3 S* r. ~2 ?滋养细胞层（feeder cells layer）的制备
" h+ m8 m* d5 k1 g, c9 U把长好的小鼠胚胎成纤维细胞的培养基吸掉，加入10ml新鲜的MEF培养基，并在避光的条件下加入110μl配好的丝裂霉素C，混匀后放入培养箱培养2h。 3 q- ]8 w7 f7 }9 E
把含有丝裂霉素C的培养基用无菌的15ml离心管收集起来避光保存，在一周之内可再次使用（直接使用该培养基处理细胞5h）。用PBS(不含二价离子)洗涤细胞2到3次后，用1ml含有EDTA的胰酶消化细胞，37℃培养箱放置约3min，直到细胞悬浮起来。
  [2 Q2 ~# b' r$ H) N用1ml MEF培养基中和胰酶的作用，之后把细胞收集到离心管里，1000×g离心5min。
+ W4 x1 M8 X$ M. o2 o$ R* a去掉上清，用1ml MEF培养基重悬细胞，之后把细胞平均分到两个经过0.1%明胶处理过的细胞培养皿中，用MEF培养基培养细胞。（明胶处理：加5ml 0.1%的明胶到细胞培养皿中，在37℃培养箱中至少放置10min，之后把明胶吸掉即可） 0 Y$ |. C% ]& n9 D1 Q9 D+ G
一般处理好的小鼠胚胎成纤维细胞在1~2h之后即可以贴壁，形成滋养细胞层，这时的滋养细胞层即可用来培养小鼠胚胎干细胞。制备好的滋养细胞层可以在MEF培养基中保持1周左右的时间，或者是把细胞冻存。 " i3 H* x( f" f" K* n' t5 B; y) \
小鼠胚胎干细胞（mouse embryonic stem cells，ES cells）的复苏
- g/ u( ]3 X4 i* i5 y1 ~5 P; l在37℃水浴锅里快速融化一管液氮冻存的小鼠胚胎干细胞。   W- U. h' W; X+ G* R
把融化的细胞悬浮液加到装有几毫升预热好的ES培养基的无菌离心管中，轻轻混匀后，1000×g ，5min离心收集细胞。 / Z: J; l/ s' d; f. U
吸掉上清（除去冻存液中的DMSO，用10ml预热的ES培养基重悬细胞后，加到一个10cm的铺有滋养细胞层的细胞培养皿中，放入37℃，含有5%CO2的加湿培养箱中培养。
7 z0 u5 ^) @" D0 ~根据情况对细胞进行换液，大约3~4天左右，细胞就可以基本长满整个培养皿，这时可以进行传代、冻存或用于后续试验。
: L8 f" |0 {0 z* \3 O: G# V# F小鼠胚胎干细胞的传代 9 l. {! f* H& R& F8 P( B
吸掉培养基，用PBS(不含二价离子)洗2~3次后，加1ml含有EDTA的胰酶消化细胞，37℃培养箱放置约5min，直到细胞基本悬浮起来。 9 }3 I) Y+ ^! C  w5 {
用1ml ES培养基中和胰酶的作用，之后把细胞收集到离心管里，1000×g离心5min。 0 }+ x9 m2 B# h0 C, g6 l% G$ u2 L: |
去掉上清，用几毫升ES培养基重悬细胞，之后根据培养皿规格和分配比，把细胞按一定比例分到铺有滋养细胞层的细胞培养皿中，加ES培养基培养。ES细胞的分配比可以是1:1到1:10。
$ s' T/ @4 t3 [1 P4 |: ^小鼠胚胎干细胞的冻存
! T3 t0 ?4 Z7 x2 E& _5 z/ R0 i吸掉培养基，用PBS(不含二价离子)洗2~3次后，加1ml含有EDTA的胰酶消化细胞，37℃培养箱放置约5min，直到细胞基本悬浮起来。 2 b( m4 ?9 {4 q
用1ml ES培养基中和胰酶的作用，之后把细胞收集到离心管里，1000×g离心5min。
4 f' m: l6 ]! h( M6 {7 ^* R去掉上清，用预先配制好的预冷的ES细胞冻存液来重悬细胞（冻存液的量视冻存的细胞量来定，一般一个长满的10cm细胞培养皿可以冻存4~6管），按每管1ml的量分装到冻存管中。梯度降温：4℃20min，-20℃20min，-80℃过夜后迅速转入液氮中。
' `; H$ D4 }8 K( W3 C, N" q5 i注意事项 ) }& d- S# i' F& {- `/ ^, ^3 T' L
丝裂霉素C在操作时要避光，避免其分解。
- K$ x9 ~" `' S5 k$ m' F3 eES细胞倾向于聚集生长，因此在复苏时，要选择好培养皿的规格
+ k, _5 M  A6 y, o% bES细胞不能长的太满，应避免使各个克隆之间接触，以免发上分化。 0 b6 i; B# p" Z/ R  D3 F
为避免水或血清带来的污染，对血清应进行支原体检测，配好的培养基要进行污染测试。

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很感谢。