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本帖最后由 细胞海洋 于 2011-2-15 23:31 编辑
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常见的干细胞培养是胚胎干细胞（ES cells）培养。我们以小鼠的胚胎干细胞培养为例。
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0 r: J$ |: Q- J0 f1 [6 x小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblasts，MEF）的复苏
- E* L. i5 s. k0 C胚胎干细胞一般是在37℃、5%CO2和95%湿度的培养条件下，生长在铺有一层滋养细胞层的细胞培养皿或者是细胞培养瓶中（此处以细胞培养皿为例）。因此要先铺滋养层细胞。
0 ?6 Z# g2 g: Y2 n& t! e
\/ D, | T5 V# B( z8 p/ ]在37℃水浴锅里快速融化一管液氮冻存的小鼠胚胎成纤维细胞。
) h( ~: ?4 G+ u. Q' |9 F把融化的细胞悬浮液加到装有几毫升预热好的MEF培养基的无菌离心管中，轻轻混匀后，1000×g ，5min离心收集细胞。
$ H+ b% M' r% ]! t( s( I2 ^5 N吸掉上清（除去冻存液中的DMSO），用10ml预热的MEF培养基重悬细胞后，加到一个10cm的细胞培养皿中，放入37℃，含有5%CO2的加湿培养箱中培养。
8 V7 p: a# \- ^- Z根据情况对细胞进行换液，大约4天左右，细胞就可以基本长满整个培养皿，这时可以进行传代、冻存或用于制备滋养细胞层。
+ y- E5 r- f: G2 r滋养细胞层（feeder cells layer）的制备 2 P+ {# n& H3 ~6 o q( |
把长好的小鼠胚胎成纤维细胞的培养基吸掉，加入10ml新鲜的MEF培养基，并在避光的条件下加入110μl配好的丝裂霉素C，混匀后放入培养箱培养2h。 2 ^* X4 D: i# I f
把含有丝裂霉素C的培养基用无菌的15ml离心管收集起来避光保存，在一周之内可再次使用（直接使用该培养基处理细胞5h）。用PBS(不含二价离子)洗涤细胞2到3次后，用1ml含有EDTA的胰酶消化细胞，37℃培养箱放置约3min，直到细胞悬浮起来。 3 J/ L, Z. {" n9 p9 y+ a; d4 }
用1ml MEF培养基中和胰酶的作用，之后把细胞收集到离心管里，1000×g离心5min。
5 }& S: K' s2 ~, H) V/ T去掉上清，用1ml MEF培养基重悬细胞，之后把细胞平均分到两个经过0.1%明胶处理过的细胞培养皿中，用MEF培养基培养细胞。（明胶处理：加5ml 0.1%的明胶到细胞培养皿中，在37℃培养箱中至少放置10min，之后把明胶吸掉即可） 3 v0 }/ c1 P. I/ q! g+ c8 V# B7 I: R) B9 v
一般处理好的小鼠胚胎成纤维细胞在1~2h之后即可以贴壁，形成滋养细胞层，这时的滋养细胞层即可用来培养小鼠胚胎干细胞。制备好的滋养细胞层可以在MEF培养基中保持1周左右的时间，或者是把细胞冻存。
`% z8 u: @) e8 R3 N小鼠胚胎干细胞（mouse embryonic stem cells，ES cells）的复苏 # b( P, y7 x* k+ ^5 E5 c1 J
在37℃水浴锅里快速融化一管液氮冻存的小鼠胚胎干细胞。
" `" g, ]4 q' Z" G* V4 H; r- i把融化的细胞悬浮液加到装有几毫升预热好的ES培养基的无菌离心管中，轻轻混匀后，1000×g ，5min离心收集细胞。 ( k- O; I7 I5 g
吸掉上清（除去冻存液中的DMSO，用10ml预热的ES培养基重悬细胞后，加到一个10cm的铺有滋养细胞层的细胞培养皿中，放入37℃，含有5%CO2的加湿培养箱中培养。 + j4 [1 e z# H# ~
根据情况对细胞进行换液，大约3~4天左右，细胞就可以基本长满整个培养皿，这时可以进行传代、冻存或用于后续试验。
% ?' ~1 c D/ `/ b2 [: o7 T! Q0 K小鼠胚胎干细胞的传代
% v: U+ r7 i! p吸掉培养基，用PBS(不含二价离子)洗2~3次后，加1ml含有EDTA的胰酶消化细胞，37℃培养箱放置约5min，直到细胞基本悬浮起来。
' O+ F ]4 E$ Y4 F! U* m, f用1ml ES培养基中和胰酶的作用，之后把细胞收集到离心管里，1000×g离心5min。 / F k1 |, \: |# z( V! q
去掉上清，用几毫升ES培养基重悬细胞，之后根据培养皿规格和分配比，把细胞按一定比例分到铺有滋养细胞层的细胞培养皿中，加ES培养基培养。ES细胞的分配比可以是1:1到1:10。 4 H( U' O+ n6 y
小鼠胚胎干细胞的冻存
8 y. S5 H, G- E* ], \吸掉培养基，用PBS(不含二价离子)洗2~3次后，加1ml含有EDTA的胰酶消化细胞，37℃培养箱放置约5min，直到细胞基本悬浮起来。 # Q5 p2 o& Z( O
用1ml ES培养基中和胰酶的作用，之后把细胞收集到离心管里，1000×g离心5min。
4 ~( e. x2 w& F1 M去掉上清，用预先配制好的预冷的ES细胞冻存液来重悬细胞（冻存液的量视冻存的细胞量来定，一般一个长满的10cm细胞培养皿可以冻存4~6管），按每管1ml的量分装到冻存管中。梯度降温：4℃20min，-20℃20min，-80℃过夜后迅速转入液氮中。
% e$ {5 `3 n5 ^: X% n) V$ l注意事项 I' {8 b B: w" I. ~
丝裂霉素C在操作时要避光，避免其分解。
! n+ G. x( c6 s6 VES细胞倾向于聚集生长，因此在复苏时，要选择好培养皿的规格
0 P) A7 o3 g% x ]1 E! l3 t C- g, tES细胞不能长的太满，应避免使各个克隆之间接触，以免发上分化。
- m: y) V5 p4 n* D( e为避免水或血清带来的污染，对血清应进行支原体检测，配好的培养基要进行污染测试。 |
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发表于 2010-12-27 14:35
发表于 2010-12-27 15:43
