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本帖最后由 细胞海洋 于 2011-2-15 23:31 编辑
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常见的干细胞培养是胚胎干细胞（ES cells）培养。我们以小鼠的胚胎干细胞培养为例。 , G3 e; ~8 b) S, J
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小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblasts，MEF）的复苏
% f9 a: h2 }) N+ V0 `0 r胚胎干细胞一般是在37℃、5%CO2和95%湿度的培养条件下，生长在铺有一层滋养细胞层的细胞培养皿或者是细胞培养瓶中（此处以细胞培养皿为例）。因此要先铺滋养层细胞。
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' m' F* @! Z8 x# T8 O在37℃水浴锅里快速融化一管液氮冻存的小鼠胚胎成纤维细胞。 4 A E Y. ^. j$ R6 N8 r% P
把融化的细胞悬浮液加到装有几毫升预热好的MEF培养基的无菌离心管中，轻轻混匀后，1000×g ，5min离心收集细胞。 ( k4 T3 m# V$ A* G
吸掉上清（除去冻存液中的DMSO），用10ml预热的MEF培养基重悬细胞后，加到一个10cm的细胞培养皿中，放入37℃，含有5%CO2的加湿培养箱中培养。
/ s. v3 ~4 ~. ]6 P; W! C/ G根据情况对细胞进行换液，大约4天左右，细胞就可以基本长满整个培养皿，这时可以进行传代、冻存或用于制备滋养细胞层。
, @, n3 J. ?9 ]3 R5 t7 k4 s滋养细胞层（feeder cells layer）的制备 & }2 u$ o: L6 N& F
把长好的小鼠胚胎成纤维细胞的培养基吸掉，加入10ml新鲜的MEF培养基，并在避光的条件下加入110μl配好的丝裂霉素C，混匀后放入培养箱培养2h。 0 @* g8 d4 k+ E7 _" M# B+ m
把含有丝裂霉素C的培养基用无菌的15ml离心管收集起来避光保存，在一周之内可再次使用（直接使用该培养基处理细胞5h）。用PBS(不含二价离子)洗涤细胞2到3次后，用1ml含有EDTA的胰酶消化细胞，37℃培养箱放置约3min，直到细胞悬浮起来。 # N5 ?$ ~& S! T: |+ t
用1ml MEF培养基中和胰酶的作用，之后把细胞收集到离心管里，1000×g离心5min。 W; U1 O/ p( d0 H8 u V
去掉上清，用1ml MEF培养基重悬细胞，之后把细胞平均分到两个经过0.1%明胶处理过的细胞培养皿中，用MEF培养基培养细胞。（明胶处理：加5ml 0.1%的明胶到细胞培养皿中，在37℃培养箱中至少放置10min，之后把明胶吸掉即可） 3 i5 d6 P5 s) _' W
一般处理好的小鼠胚胎成纤维细胞在1~2h之后即可以贴壁，形成滋养细胞层，这时的滋养细胞层即可用来培养小鼠胚胎干细胞。制备好的滋养细胞层可以在MEF培养基中保持1周左右的时间，或者是把细胞冻存。
! q1 J$ _+ H; B小鼠胚胎干细胞（mouse embryonic stem cells，ES cells）的复苏
; ]3 @# l# h) v在37℃水浴锅里快速融化一管液氮冻存的小鼠胚胎干细胞。
; L3 s# j! ?2 Z% n2 T8 G( Y' W0 C把融化的细胞悬浮液加到装有几毫升预热好的ES培养基的无菌离心管中，轻轻混匀后，1000×g ，5min离心收集细胞。 # s' I: B K8 T! V4 o0 H( i, e
吸掉上清（除去冻存液中的DMSO，用10ml预热的ES培养基重悬细胞后，加到一个10cm的铺有滋养细胞层的细胞培养皿中，放入37℃，含有5%CO2的加湿培养箱中培养。
- ^1 L: r/ E! F2 i. k% B _4 W根据情况对细胞进行换液，大约3~4天左右，细胞就可以基本长满整个培养皿，这时可以进行传代、冻存或用于后续试验。
2 ~/ H( ^5 x5 B! U* {9 h# y) E小鼠胚胎干细胞的传代 2 S2 C! t2 C O3 j
吸掉培养基，用PBS(不含二价离子)洗2~3次后，加1ml含有EDTA的胰酶消化细胞，37℃培养箱放置约5min，直到细胞基本悬浮起来。
, U, C" V; ^- x" d用1ml ES培养基中和胰酶的作用，之后把细胞收集到离心管里，1000×g离心5min。
& Z" I5 t! H- u6 j去掉上清，用几毫升ES培养基重悬细胞，之后根据培养皿规格和分配比，把细胞按一定比例分到铺有滋养细胞层的细胞培养皿中，加ES培养基培养。ES细胞的分配比可以是1:1到1:10。
- [) Q: V' _ p* p: S: J+ ?# N小鼠胚胎干细胞的冻存 # }$ i) y r( _- T- A% J) y& [: M
吸掉培养基，用PBS(不含二价离子)洗2~3次后，加1ml含有EDTA的胰酶消化细胞，37℃培养箱放置约5min，直到细胞基本悬浮起来。 " s& \, R' n5 L( ?* Y. `9 ?
用1ml ES培养基中和胰酶的作用，之后把细胞收集到离心管里，1000×g离心5min。 - Q* |7 W( j2 d; t
去掉上清，用预先配制好的预冷的ES细胞冻存液来重悬细胞（冻存液的量视冻存的细胞量来定，一般一个长满的10cm细胞培养皿可以冻存4~6管），按每管1ml的量分装到冻存管中。梯度降温：4℃20min，-20℃20min，-80℃过夜后迅速转入液氮中。
* x: _$ f& F( u9 q注意事项
: T6 w4 s) `, b丝裂霉素C在操作时要避光，避免其分解。 ( g' n( D) G0 Y# j
ES细胞倾向于聚集生长，因此在复苏时，要选择好培养皿的规格
C, V3 G4 y9 P) c) |ES细胞不能长的太满，应避免使各个克隆之间接触，以免发上分化。
* T9 v8 ~9 ^6 K: S为避免水或血清带来的污染，对血清应进行支原体检测，配好的培养基要进行污染测试。 |
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发表于 2010-12-27 14:35
发表于 2010-12-27 15:43
