关于ES细胞培养液的pH问题

carolshen

在文献中，基本上没有提过这个问题，想请问下这里的朋友们，请问你们在培养ES细胞时，考虑了培养液的pH吗？

hyde

请教各种细胞培养基的颜色3 W4 Y# v: ?* N. Y: p
http://www.stemcell8.cn/thread-25937-1-1.html* _# b0 t3 C5 d: s1 }) {' h

痞子的烟头

以前我们实验室用的都是买的培养基DF12，其它的直接加上就可以用，没有测试PH，但是如果是自己的配，必须要测试！

上海过客

新配出来的 培养基是亮黄色 。 加进去过一段时间 后变红色 。 再变成黄色 就不能用了 。
, h4 O4 Q& ]( J2 k; V, |( N) x, _# W! A

carolshen

呃，不好意思，谢谢大家的关注！
7 \$ A4 C# S& l. S, U; }忘说明一下，我用的是条件培养基，就是制完conditioned medium之后，你们还有调节pH吗？

heather_lu

一般不调

syl82

, E6 v8 b' Y) g
% b2 P* `% B  x4 M" i5 J* l
常见的干细胞培养是胚胎干细胞（ES cells）培养。我们以小鼠的胚胎干细胞培养为例。
1 S4 a; ]/ v; C) q! F
2 `1 \! E; Y( e! I( h2 ?' _小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblasts，MEF）的复苏
( ~2 g! b. Z! ~- m8 w胚胎干细胞一般是在37℃、5%CO2和95%湿度的培养条件下，生长在铺有一层滋养细胞层的细胞培养皿或者是细胞培养瓶中（此处以细胞培养皿为例）。因此要先铺滋养层细胞。
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1 W0 b- I& p. l$ s. G. D- y3 [3 ?( C在37℃水浴锅里快速融化一管液氮冻存的小鼠胚胎成纤维细胞。 * J& C. s$ y' b( h5 x7 }" h- R
把融化的细胞悬浮液加到装有几毫升预热好的MEF培养基的无菌离心管中，轻轻混匀后，1000×g ，5min离心收集细胞。 ! G) r1 M! p6 \. _
吸掉上清（除去冻存液中的DMSO），用10ml预热的MEF培养基重悬细胞后，加到一个10cm的细胞培养皿中，放入37℃，含有5%CO2的加湿培养箱中培养。
+ H' o) P- x) K0 E根据情况对细胞进行换液，大约4天左右，细胞就可以基本长满整个培养皿，这时可以进行传代、冻存或用于制备滋养细胞层。
, a7 N- X0 f6 q1 I5 h& m- K滋养细胞层（feeder cells layer）的制备
3 f9 B( n# G+ j: y把长好的小鼠胚胎成纤维细胞的培养基吸掉，加入10ml新鲜的MEF培养基，并在避光的条件下加入110μl配好的丝裂霉素C，混匀后放入培养箱培养2h。 ) p4 `% u- b4 r
把含有丝裂霉素C的培养基用无菌的15ml离心管收集起来避光保存，在一周之内可再次使用（直接使用该培养基处理细胞5h）。用PBS(不含二价离子)洗涤细胞2到3次后，用1ml含有EDTA的胰酶消化细胞，37℃培养箱放置约3min，直到细胞悬浮起来。
& W- @! h" _  c! Y# ^& j用1ml MEF培养基中和胰酶的作用，之后把细胞收集到离心管里，1000×g离心5min。
9 X/ j; k7 g+ p, q, A' M去掉上清，用1ml MEF培养基重悬细胞，之后把细胞平均分到两个经过0.1%明胶处理过的细胞培养皿中，用MEF培养基培养细胞。（明胶处理：加5ml 0.1%的明胶到细胞培养皿中，在37℃培养箱中至少放置10min，之后把明胶吸掉即可） & Q$ p9 M8 [2 x& i$ T
一般处理好的小鼠胚胎成纤维细胞在1~2h之后即可以贴壁，形成滋养细胞层，这时的滋养细胞层即可用来培养小鼠胚胎干细胞。制备好的滋养细胞层可以在MEF培养基中保持1周左右的时间，或者是把细胞冻存。
8 O- I/ [) u. a2 y小鼠胚胎干细胞（mouse embryonic stem cells，ES cells）的复苏 + u* ?. t7 y/ Z; G: d( S
在37℃水浴锅里快速融化一管液氮冻存的小鼠胚胎干细胞。 , R  P& F: b: P9 O+ N: F, }9 u
把融化的细胞悬浮液加到装有几毫升预热好的ES培养基的无菌离心管中，轻轻混匀后，1000×g ，5min离心收集细胞。 / J9 |- B' M' {
吸掉上清（除去冻存液中的DMSO，用10ml预热的ES培养基重悬细胞后，加到一个10cm的铺有滋养细胞层的细胞培养皿中，放入37℃，含有5%CO2的加湿培养箱中培养。 2 O, E' Q( a' n- R. P: k
根据情况对细胞进行换液，大约3~4天左右，细胞就可以基本长满整个培养皿，这时可以进行传代、冻存或用于后续试验。 , c2 L6 m8 W5 K
小鼠胚胎干细胞的传代 2 g, k0 L) ~" k- B6 j& y9 ~+ e
吸掉培养基，用PBS(不含二价离子)洗2~3次后，加1ml含有EDTA的胰酶消化细胞，37℃培养箱放置约5min，直到细胞基本悬浮起来。
, |; {; M- P9 S9 i8 Z; x& O# }用1ml ES培养基中和胰酶的作用，之后把细胞收集到离心管里，1000×g离心5min。 * z, G% ~# z4 R) E5 N- Q* K
去掉上清，用几毫升ES培养基重悬细胞，之后根据培养皿规格和分配比，把细胞按一定比例分到铺有滋养细胞层的细胞培养皿中，加ES培养基培养。ES细胞的分配比可以是1:1到1:10。
8 V% W# y3 i, T0 s: Q小鼠胚胎干细胞的冻存
) G; D, z; s7 ]- i4 N吸掉培养基，用PBS(不含二价离子)洗2~3次后，加1ml含有EDTA的胰酶消化细胞，37℃培养箱放置约5min，直到细胞基本悬浮起来。
8 w( O- R# ]- f0 R# i用1ml ES培养基中和胰酶的作用，之后把细胞收集到离心管里，1000×g离心5min。
( _& O' Y( x; t; W去掉上清，用预先配制好的预冷的ES细胞冻存液来重悬细胞（冻存液的量视冻存的细胞量来定，一般一个长满的10cm细胞培养皿可以冻存4~6管），按每管1ml的量分装到冻存管中。梯度降温：4℃20min，-20℃20min，-80℃过夜后迅速转入液氮中。
" T/ P- s9 v1 p, M注意事项 8 @& G4 c7 W1 s! K2 D
丝裂霉素C在操作时要避光，避免其分解。   e* U. A$ }5 _4 i* p
ES细胞倾向于聚集生长，因此在复苏时，要选择好培养皿的规格 # X. |- m9 l5 y* W4 y6 a
ES细胞不能长的太满，应避免使各个克隆之间接触，以免发上分化。
) ]9 B6 \, |+ ]( _为避免水或血清带来的污染，对血清应进行支原体检测，配好的培养基要进行污染测试。