关于ES细胞培养液的pH问题

carolshen

在文献中，基本上没有提过这个问题，想请问下这里的朋友们，请问你们在培养ES细胞时，考虑了培养液的pH吗？

hyde

请教各种细胞培养基的颜色
- d& q' n7 A- yhttp://www.stemcell8.cn/thread-25937-1-1.html, U3 N5 I+ k1 I" c, v  V

痞子的烟头

以前我们实验室用的都是买的培养基DF12，其它的直接加上就可以用，没有测试PH，但是如果是自己的配，必须要测试！

上海过客

新配出来的 培养基是亮黄色 。 加进去过一段时间 后变红色 。 再变成黄色 就不能用了 。
" V  ]4 X" _" f8 M% z2 w
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carolshen

呃，不好意思，谢谢大家的关注！6 T9 A4 {! t6 B$ k/ ]" h5 {
忘说明一下，我用的是条件培养基，就是制完conditioned medium之后，你们还有调节pH吗？

heather_lu

一般不调

syl82

3 F1 f' _; q2 T, O
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常见的干细胞培养是胚胎干细胞（ES cells）培养。我们以小鼠的胚胎干细胞培养为例。 6 `* _' U# `5 Z
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小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblasts，MEF）的复苏 8 h# J; \8 l3 P0 j
胚胎干细胞一般是在37℃、5%CO2和95%湿度的培养条件下，生长在铺有一层滋养细胞层的细胞培养皿或者是细胞培养瓶中（此处以细胞培养皿为例）。因此要先铺滋养层细胞。
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在37℃水浴锅里快速融化一管液氮冻存的小鼠胚胎成纤维细胞。 ' I" ^8 v9 a  T7 W) g# g/ @$ O
把融化的细胞悬浮液加到装有几毫升预热好的MEF培养基的无菌离心管中，轻轻混匀后，1000×g ，5min离心收集细胞。
) w7 c2 Q0 z+ m  ~吸掉上清（除去冻存液中的DMSO），用10ml预热的MEF培养基重悬细胞后，加到一个10cm的细胞培养皿中，放入37℃，含有5%CO2的加湿培养箱中培养。 2 ?1 c6 }. a/ f3 _! a) C
根据情况对细胞进行换液，大约4天左右，细胞就可以基本长满整个培养皿，这时可以进行传代、冻存或用于制备滋养细胞层。 ! D) Q5 m9 d: u% N$ u
滋养细胞层（feeder cells layer）的制备
5 H: B; W% K; w! x# n把长好的小鼠胚胎成纤维细胞的培养基吸掉，加入10ml新鲜的MEF培养基，并在避光的条件下加入110μl配好的丝裂霉素C，混匀后放入培养箱培养2h。 2 t2 G# w9 V1 \1 V' }
把含有丝裂霉素C的培养基用无菌的15ml离心管收集起来避光保存，在一周之内可再次使用（直接使用该培养基处理细胞5h）。用PBS(不含二价离子)洗涤细胞2到3次后，用1ml含有EDTA的胰酶消化细胞，37℃培养箱放置约3min，直到细胞悬浮起来。
* u: Q, _4 O( x# A0 G用1ml MEF培养基中和胰酶的作用，之后把细胞收集到离心管里，1000×g离心5min。 % g# k0 a: S) D- t. R& N2 A
去掉上清，用1ml MEF培养基重悬细胞，之后把细胞平均分到两个经过0.1%明胶处理过的细胞培养皿中，用MEF培养基培养细胞。（明胶处理：加5ml 0.1%的明胶到细胞培养皿中，在37℃培养箱中至少放置10min，之后把明胶吸掉即可） 7 [" m* D9 r% ~6 c4 a
一般处理好的小鼠胚胎成纤维细胞在1~2h之后即可以贴壁，形成滋养细胞层，这时的滋养细胞层即可用来培养小鼠胚胎干细胞。制备好的滋养细胞层可以在MEF培养基中保持1周左右的时间，或者是把细胞冻存。 , v5 ?  q0 ?# W" g0 @2 _0 k
小鼠胚胎干细胞（mouse embryonic stem cells，ES cells）的复苏 1 T3 v' Z+ d* b( z4 d' o7 [: x
在37℃水浴锅里快速融化一管液氮冻存的小鼠胚胎干细胞。
. q) [# Y1 R- M! Q把融化的细胞悬浮液加到装有几毫升预热好的ES培养基的无菌离心管中，轻轻混匀后，1000×g ，5min离心收集细胞。
- X6 k9 F) u- f) X5 b4 S0 J1 F/ \吸掉上清（除去冻存液中的DMSO，用10ml预热的ES培养基重悬细胞后，加到一个10cm的铺有滋养细胞层的细胞培养皿中，放入37℃，含有5%CO2的加湿培养箱中培养。 8 {! F$ u1 r7 u2 E
根据情况对细胞进行换液，大约3~4天左右，细胞就可以基本长满整个培养皿，这时可以进行传代、冻存或用于后续试验。
5 k( K, K$ B' A; o小鼠胚胎干细胞的传代
0 O' ^' G0 l# ~+ |/ K吸掉培养基，用PBS(不含二价离子)洗2~3次后，加1ml含有EDTA的胰酶消化细胞，37℃培养箱放置约5min，直到细胞基本悬浮起来。 / q5 h+ K; e+ s6 T( F2 H! k
用1ml ES培养基中和胰酶的作用，之后把细胞收集到离心管里，1000×g离心5min。 ! ~# g, d0 o( P3 ]$ Y4 y& P
去掉上清，用几毫升ES培养基重悬细胞，之后根据培养皿规格和分配比，把细胞按一定比例分到铺有滋养细胞层的细胞培养皿中，加ES培养基培养。ES细胞的分配比可以是1:1到1:10。 & X2 B: c! y, i! b2 ?
小鼠胚胎干细胞的冻存 $ u, o* z  v5 X6 I  a
吸掉培养基，用PBS(不含二价离子)洗2~3次后，加1ml含有EDTA的胰酶消化细胞，37℃培养箱放置约5min，直到细胞基本悬浮起来。 % v9 n: D1 t" p5 h( ~
用1ml ES培养基中和胰酶的作用，之后把细胞收集到离心管里，1000×g离心5min。
) s: J3 G) J. W- `. e) W: r去掉上清，用预先配制好的预冷的ES细胞冻存液来重悬细胞（冻存液的量视冻存的细胞量来定，一般一个长满的10cm细胞培养皿可以冻存4~6管），按每管1ml的量分装到冻存管中。梯度降温：4℃20min，-20℃20min，-80℃过夜后迅速转入液氮中。 ) ~# g2 M( i, f. t" @3 b
注意事项 2 @1 L+ a  Y3 ~+ a# i6 Y
丝裂霉素C在操作时要避光，避免其分解。 . Y! _7 _& k* n" l/ v' T1 i/ p( {
ES细胞倾向于聚集生长，因此在复苏时，要选择好培养皿的规格 , g2 b- [! K( X9 ?. ?: g7 V
ES细胞不能长的太满，应避免使各个克隆之间接触，以免发上分化。
, F+ G  P1 @2 v2 n( C& S  U为避免水或血清带来的污染，对血清应进行支原体检测，配好的培养基要进行污染测试。