求助关于肿瘤干细胞微球体的传代

cookiezhang

肿瘤细胞在无血清培养基中形成微球体之后，传代的时候要用胰酶-EDTA先消化，吹打形成单细胞悬液，然后离心，之后重悬分装吗？是这样做吗？
, `* i$ T( I4 S' x: V8 ~4 ` 大家都要用胰酶-EDTA消化吗？

深海寂寞鱼

to cookiezhang：4 F% e3 T7 v) Z( f" b& d4 S

* V7 w4 `( X0 g- G1 \肿瘤干细胞的微球体或者说肿瘤球的传代过程大概是这样的：. S% u7 ?- y; q, [

) Y6 |5 t; k; ^0 r) [( Y, |1. 离心收集肿瘤球：300g ， 5min5 k- u% E0 ]4 P% ?
2. 弃掉培养基，用PBS重悬肿瘤球9 b- Z7 U6 `1 z. i; w5 u! a
3. 离心后弃掉PBS: [) `: g1 ~- k! R) ~+ {; c# O( D0 l
4. 胰酶－EDTA重悬，消化肿瘤球（一般 37度，5min；可根据经验调整时间）。每1-2分钟，用手指Tap离心管底部，使细胞悬浮。
% s  r; u2 Q* J: c: l  _5. 加入培养基终止消化，适度吹打使细胞进一步分散9 S7 B! \" F& e+ A; Y, L( Z
6. 离心后弃掉上清，培养基重悬，按适当密度接种。
4 T# v" W9 \2 _0 Q
# H/ r8 m! R- V0 {这只是一个大概的操作过程，其中的每一步都可以根据自己的经验，尤其是自己的细胞状态，进行相应的调整。
0 Y$ V6 M2 e% o5 j; m4 w
& H& V$ L$ e6 o" _' g) p# |我现在基本上用Accutase代替胰酶－EDTA消化肿瘤球了。主观上感觉损伤好像能小一些。但是胰酶－EDTA绝对是可以用。" a$ Q; H/ m# u! |6 |
# X4 k/ z$ s3 V* ?0 f- x3 o
你先按照这个流程试试看。如果有什么问题可以再交流。

cookiezhang

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8 J" Z0 d! J& B- n非常感谢深海寂寞鱼。

cookiezhang

回复 深海寂寞鱼 的帖子5 c5 G. r. I6 g2 \" [, H" j3 J

; t1 Y! X7 ~9 ?0 }3 p, [9 b想请教深海寂寞鱼：培养细胞球用的细胞因子EGF、bFGF，你用的是什么公司的，是直接分装就可以用的，还是有干粉自己配制的，哪种比较合适啊？

深海寂寞鱼

回复 cookiezhang 的帖子& f- h; W1 d4 {/ p, @' N9 Y( i

" k6 |* ?, F4 ?8 i8 Lto cookiezhang：
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7 H3 P# S+ \. }3 @    我用的EGF和bFGF都是Peprotech公司的。都是干粉。自己配制后使用。

jamquit

回复 深海寂寞鱼 的帖子/ }' G& m4 F7 P3 m/ F0 i) A8 ~, P; R
/ B3 h1 `3 F* ~/ ^% L# y
请教下深海同学 有师兄建议我的无血清培养中除了EGF bFGF 还添加白血病抑制因子 不过我看白血病抑制因子是促进细胞分化的呀 而且像胰岛素这些需要吗？还是只是EGF bFGF B27加两抗就行了？

深海寂寞鱼

to jamquit：请问你打算培养什么细胞？然后我才可能稍微准确的回答你的问题。8 z, L0 y9 e9 J
2 r7 G. o' f# L3 C

! U0 |, \) B) c0 i: O5 ^
, F/ v. O. |9 ?0 ?) b另外，有个小建议：希望你能自己多看文献。因为任何人给你的建议都是从自己的主观出发的，适不适你，你自己必须学会判断。& x' y0 U4 X5 _* D( h2 k9 f; M, @& a

- x. y  o" |5 S8 P$ p而判断的标准一般需要从你读文献中获得。
3 J; [1 u/ y) ^& p; {+ H4 @9 _- b; k, i5 ~, e; b4 I) O7 l6 I
比如，你师兄建议你不加EGF和bFGF，你就可以问问他不加的原因是什么？有什么好处，有什么缺点。加入LIF又有什么优点，可能带来什么不足？
% J; _4 g( H# o. s2 E0 ?  Q9 y
: T) g1 M5 ]( I1 {再进一步，你应该通过查找资料明白EGF、bFGF，LIF它们各自可能的作用是什么。
! Y/ e) V; k: M2 N' K5 Q* Z1 K# A
( w' T" t& l+ ^, r只有这样，你后面的实验才可能很好的开展。
4 {# q# f" E; O# i- M
- {: M' J' _: S* H5 s4 ^+ R4 A7 B2 ?个人的深刻感受，与你分享。希望你能明白。

jamquit

回复 深海寂寞鱼 的帖子5 K6 f, L9 A0 ~3 {5 R1 Z$ G

+ R# w. {6 |% g# i恩恩 谢谢~~~~等我再多看点儿文献了再找你探讨吧~~

lh_kitty

回复 深海寂寞鱼 的帖子
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& b5 G8 J- I1 [4 v2 E- r你好，请问你培养的是什么肿瘤干细胞？我现在在养食管癌细胞，用无血清培养基养出来的细胞总是有贴壁的，传了几代之后还是有悬浮有贴壁的，不知怎么解释，想请教一下你在养细胞的时候是否遇到这种情况？

深海寂寞鱼

to lh_kitty：这种问题当然经常遇到啦。
! c2 d/ ^% ]+ y, p( t1 x6 [9 R+ Y* F0 c1 \- C# s
                我养过几种肿瘤的原代组织，但是确实没有养过食管癌组织。
$ A8 |- s* L+ Q( @( q7 _1 ?# U
- r! w* C8 f$ l" O) E6 J                就我的经历来看，胶质瘤的原代组织会乖乖的长成悬浮的肿瘤球，贴壁的较少。
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: p: }$ S5 O, h+ s% C                其它的肿瘤都有不同程度的贴壁，有些会比较严重。9 q& {( G$ K' U; ], G  t
6 F& u) A* t1 k  [! |
                论坛里对于这个问题，大家也都有提到。解决的方法或者说改善的方法，大概有：( g4 G) ^+ c; Y9 C

1 l7 g% ~- V  z7 v- M                1. 如果实验室条件允许，尽量用超低粘附的皿来进行培养。
" i8 s. ?) a9 F! ]
- |( j! n' d) {0 g                2. 控制细胞的接种密度，稍微稀一点。
/ o+ ]) s4 w( M7 L" a! i  Y
5 Y) |" I$ e6 C) U) m                3. 多加一些培养基。
4 {* K! P0 P( Z9 Y, `: A% c* `+ x
               你可以按照上面的方法试试看，个人觉得你是不是细胞接种的比较密。. T( y& a- k. j7 f) i" h; n% f1 G
; Y9 I' f' v  W5 v' }
               当然我一向的观点都是尽量多看这领域的经典文献，从中找到解决问题的方法。5 x1 c" ]& x1 X4 q; Z8 ^
- f4 W( V4 o1 ~
               如果你认为悬浮状态的是你需要的细胞，传代时尽量轻轻的吸取培养基进行传代，贴壁的暂时可以考虑舍弃。/ s" E0 i+ i7 `* z

. e( F. \) k0 g; N6 P: i       你问我对于这个问题的解释。说实话，我还没有太想明白。  
4 P7 p2 v2 m8 R3 \: s# |7 H: Q3 X- Z, `7 W
       但是通常会认为贴壁的细胞可能是分化了的或者开始分化的细胞。我还在观望中。