求助关于肿瘤干细胞微球体的传代

cookiezhang

肿瘤细胞在无血清培养基中形成微球体之后，传代的时候要用胰酶-EDTA先消化，吹打形成单细胞悬液，然后离心，之后重悬分装吗？是这样做吗？/ J# j5 }8 x0 j! k$ A1 {. _2 s  e, b
大家都要用胰酶-EDTA消化吗？

深海寂寞鱼

to cookiezhang：% X  w; a5 i0 q3 Y

* m# W$ x) J+ q; Q" T肿瘤干细胞的微球体或者说肿瘤球的传代过程大概是这样的：  ?4 D0 H/ p9 B' [- f8 ~1 C
- ^& ?* C. J! n6 F1 Y  A
1. 离心收集肿瘤球：300g ， 5min. k1 }% W' o7 O3 N
2. 弃掉培养基，用PBS重悬肿瘤球
2 A' `# c$ |6 ?1 |! ]3 x+ b8 w0 `3. 离心后弃掉PBS* L8 G) ]4 s" N$ c  [
4. 胰酶－EDTA重悬，消化肿瘤球（一般 37度，5min；可根据经验调整时间）。每1-2分钟，用手指Tap离心管底部，使细胞悬浮。- y1 o; F1 M6 p0 ]6 m
5. 加入培养基终止消化，适度吹打使细胞进一步分散3 q% T1 k0 O; G8 f9 B
6. 离心后弃掉上清，培养基重悬，按适当密度接种。) Z0 R+ F  E  U' T$ A
0 M1 A9 V. \  _. j& j2 R0 [  x
这只是一个大概的操作过程，其中的每一步都可以根据自己的经验，尤其是自己的细胞状态，进行相应的调整。/ P/ V- v% |7 m5 ]  I2 Y% ?. ~

0 I) U" v) ]0 A# I- r我现在基本上用Accutase代替胰酶－EDTA消化肿瘤球了。主观上感觉损伤好像能小一些。但是胰酶－EDTA绝对是可以用。4 Z! z5 ^" D. _( u' N+ B
3 }" N% g/ o0 g
你先按照这个流程试试看。如果有什么问题可以再交流。

cookiezhang

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* p  D$ g+ ^5 F0 s5 k  n* v8 K, R
, \: a$ N6 Z$ c' k非常感谢深海寂寞鱼。

cookiezhang

回复 深海寂寞鱼 的帖子/ b( a9 k( r4 ^2 N& B# C. l
& Q* G1 M! K' C* L
想请教深海寂寞鱼：培养细胞球用的细胞因子EGF、bFGF，你用的是什么公司的，是直接分装就可以用的，还是有干粉自己配制的，哪种比较合适啊？

深海寂寞鱼

回复 cookiezhang 的帖子1 I+ o4 Q- X( a6 @9 o* S) S
: S& }% h6 ?: t
to cookiezhang：
% E) ]# M4 ~8 c6 W: j* k: g' N! g6 n$ l" Z( O# v
    我用的EGF和bFGF都是Peprotech公司的。都是干粉。自己配制后使用。

jamquit

回复 深海寂寞鱼 的帖子
4 I( U4 T. ^) I7 p- i! p) {9 v, @! v" G; o4 L( m& M- m& y
请教下深海同学 有师兄建议我的无血清培养中除了EGF bFGF 还添加白血病抑制因子 不过我看白血病抑制因子是促进细胞分化的呀 而且像胰岛素这些需要吗？还是只是EGF bFGF B27加两抗就行了？

深海寂寞鱼

to jamquit：请问你打算培养什么细胞？然后我才可能稍微准确的回答你的问题。
- z  M% L& ^" U! W6 K( a/ \( H4 e
) c# S  z9 i) W. R& G  T! b, ~* Q0 k" j& B0 T
) n8 Z' R: j: b( H" i& u
另外，有个小建议：希望你能自己多看文献。因为任何人给你的建议都是从自己的主观出发的，适不适你，你自己必须学会判断。7 f. z, q" Z( G" Z

. z0 ^2 e  N% Q0 z+ l/ r而判断的标准一般需要从你读文献中获得。. c  D1 o: o- H: d1 L2 f8 K! @

+ v4 _# w) z# i! A4 Z0 Q  i比如，你师兄建议你不加EGF和bFGF，你就可以问问他不加的原因是什么？有什么好处，有什么缺点。加入LIF又有什么优点，可能带来什么不足？
3 R& [; p9 p9 }: I1 M" r# N/ H" m+ F$ j- l" D. U' t4 \
再进一步，你应该通过查找资料明白EGF、bFGF，LIF它们各自可能的作用是什么。
% E  p4 D" t5 m3 Z( m$ e
, M) T* ]  y7 @只有这样，你后面的实验才可能很好的开展。
' l3 b" n8 I8 t% F7 h0 I7 ?1 [4 F4 K3 @: @
个人的深刻感受，与你分享。希望你能明白。

jamquit

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, [  v: s8 Y$ ~' D# I4 g
: U7 P2 O' b( B恩恩 谢谢~~~~等我再多看点儿文献了再找你探讨吧~~

lh_kitty

回复 深海寂寞鱼 的帖子0 I6 D) X0 ?+ e/ R# P5 }1 ~

( W) H7 M  ^  p$ W7 T你好，请问你培养的是什么肿瘤干细胞？我现在在养食管癌细胞，用无血清培养基养出来的细胞总是有贴壁的，传了几代之后还是有悬浮有贴壁的，不知怎么解释，想请教一下你在养细胞的时候是否遇到这种情况？

深海寂寞鱼

to lh_kitty：这种问题当然经常遇到啦。
- O" {/ ~5 W" h. e1 q% |
% M5 [1 s. Z1 ~. o/ y3 y                我养过几种肿瘤的原代组织，但是确实没有养过食管癌组织。3 W4 Y) `7 r- Q% H0 X  P% s

" t/ N( b1 E! ^; j2 N7 v" F                就我的经历来看，胶质瘤的原代组织会乖乖的长成悬浮的肿瘤球，贴壁的较少。% p* p. O* h( N4 w
4 `" |! n3 W; M( }
                其它的肿瘤都有不同程度的贴壁，有些会比较严重。
( F- E: X/ u2 r( ^3 ^2 O* P
! V7 G. x/ L9 G  o$ J                论坛里对于这个问题，大家也都有提到。解决的方法或者说改善的方法，大概有：$ Z/ I: k# N6 U% K# g4 ]( P

# l2 H. b+ B! ]: {5 B3 Z                1. 如果实验室条件允许，尽量用超低粘附的皿来进行培养。
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3 t* F" S( {: i. o0 Z                2. 控制细胞的接种密度，稍微稀一点。
8 T( K+ ~, u5 w9 a
2 o: N) x$ u; D; s* }- l& X                3. 多加一些培养基。
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               你可以按照上面的方法试试看，个人觉得你是不是细胞接种的比较密。
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8 h8 j. K5 t- L  l! a" K! M- N               当然我一向的观点都是尽量多看这领域的经典文献，从中找到解决问题的方法。
% D0 H1 a% c7 d* j  T
& ^$ F8 J" Z* ~' c) L' q. x               如果你认为悬浮状态的是你需要的细胞，传代时尽量轻轻的吸取培养基进行传代，贴壁的暂时可以考虑舍弃。
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$ S5 c5 |* }3 v+ O2 C       你问我对于这个问题的解释。说实话，我还没有太想明白。  / Z1 w0 Q$ o! E0 K; `" Z

+ n" r5 ~" q; S7 `       但是通常会认为贴壁的细胞可能是分化了的或者开始分化的细胞。我还在观望中。