求助关于肿瘤干细胞微球体的传代

cookiezhang

肿瘤细胞在无血清培养基中形成微球体之后，传代的时候要用胰酶-EDTA先消化，吹打形成单细胞悬液，然后离心，之后重悬分装吗？是这样做吗？! ~7 R1 l) m+ v
大家都要用胰酶-EDTA消化吗？

深海寂寞鱼

to cookiezhang：4 U* d/ o# g0 {& W

8 S/ M2 H8 l" m5 Q" T( j0 n肿瘤干细胞的微球体或者说肿瘤球的传代过程大概是这样的：
$ @9 c7 e! y( w, R# m$ Z) X$ K7 Y1 s! z! i+ [
1. 离心收集肿瘤球：300g ， 5min) g+ ?% ?* ^! g# K6 L
2. 弃掉培养基，用PBS重悬肿瘤球, ^6 \$ w( h  L
3. 离心后弃掉PBS( e; n8 i; c1 N7 E
4. 胰酶－EDTA重悬，消化肿瘤球（一般 37度，5min；可根据经验调整时间）。每1-2分钟，用手指Tap离心管底部，使细胞悬浮。6 f! ?4 q# N/ h0 b% W
5. 加入培养基终止消化，适度吹打使细胞进一步分散
$ x5 P3 R3 M& H& W3 m/ @6. 离心后弃掉上清，培养基重悬，按适当密度接种。* R' g9 {' Z7 i) {/ I
7 b0 n- V. D) j, [  ^. v" r
这只是一个大概的操作过程，其中的每一步都可以根据自己的经验，尤其是自己的细胞状态，进行相应的调整。0 V- E; V- Z0 f0 a
7 c& h# T* e- [, B: P
我现在基本上用Accutase代替胰酶－EDTA消化肿瘤球了。主观上感觉损伤好像能小一些。但是胰酶－EDTA绝对是可以用。
1 x1 B) f* q+ o+ H' P
) ?" k/ G' s: h" f2 i; ~你先按照这个流程试试看。如果有什么问题可以再交流。

cookiezhang

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# Y) H: I) r4 b* w) V- @
" q/ O* A8 a6 @4 E/ @非常感谢深海寂寞鱼。

cookiezhang

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; D5 X' O; j: S9 u. K
0 k( i& {3 K. a, X  i! F* n想请教深海寂寞鱼：培养细胞球用的细胞因子EGF、bFGF，你用的是什么公司的，是直接分装就可以用的，还是有干粉自己配制的，哪种比较合适啊？

深海寂寞鱼

回复 cookiezhang 的帖子# L' S' Z  @# L9 D, m
% Y! z5 o4 q! Q; s: m' S
to cookiezhang：
& F# d: k" N7 q' ^. M' l. ?# o
8 }+ d# H  W  @, w5 X! T( A8 k& ~% f% B    我用的EGF和bFGF都是Peprotech公司的。都是干粉。自己配制后使用。

jamquit

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: \5 [* B/ W2 L9 B3 s) {/ r/ C, S0 V3 O( i2 V; t8 A
请教下深海同学 有师兄建议我的无血清培养中除了EGF bFGF 还添加白血病抑制因子 不过我看白血病抑制因子是促进细胞分化的呀 而且像胰岛素这些需要吗？还是只是EGF bFGF B27加两抗就行了？

深海寂寞鱼

to jamquit：请问你打算培养什么细胞？然后我才可能稍微准确的回答你的问题。
) D' {* ]7 n$ @1 u+ j8 Z# J6 x7 j1 K

7 z4 }+ X1 c% M( M0 Y6 ^5 C* |- o) T# v, Y! e
另外，有个小建议：希望你能自己多看文献。因为任何人给你的建议都是从自己的主观出发的，适不适你，你自己必须学会判断。
, Y: ]3 ^- M; c# b# ~
8 q6 ?% l. u& g* N* s5 p) D而判断的标准一般需要从你读文献中获得。2 D% n+ F/ r! M' a- {8 @

' O1 ]0 r4 ~+ j' X2 t# ~% u( ~6 z比如，你师兄建议你不加EGF和bFGF，你就可以问问他不加的原因是什么？有什么好处，有什么缺点。加入LIF又有什么优点，可能带来什么不足？
: w) F/ [" Y/ _: p. J3 N6 e; \1 W$ s% l+ b! r* ?5 h0 D. E
再进一步，你应该通过查找资料明白EGF、bFGF，LIF它们各自可能的作用是什么。( }3 \) }. N  H+ Y! n( U

0 O  B9 y! f- p  G" G; T, F1 i只有这样，你后面的实验才可能很好的开展。4 V9 v6 \; x2 y" ]) U. {
8 j5 u$ j9 \1 B* j( p5 ~0 z3 ^
个人的深刻感受，与你分享。希望你能明白。

jamquit

回复 深海寂寞鱼 的帖子  ]1 a. D0 L2 w3 N# W
6 f* ]+ g$ s. {) i
恩恩 谢谢~~~~等我再多看点儿文献了再找你探讨吧~~

lh_kitty

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4 u6 V6 X% g0 m1 r% s; K$ A2 z, C; d) {/ B9 O' {# O
你好，请问你培养的是什么肿瘤干细胞？我现在在养食管癌细胞，用无血清培养基养出来的细胞总是有贴壁的，传了几代之后还是有悬浮有贴壁的，不知怎么解释，想请教一下你在养细胞的时候是否遇到这种情况？

深海寂寞鱼

to lh_kitty：这种问题当然经常遇到啦。: p; ]1 m% J% h' M% j$ D, ?' J

2 L/ Q! \8 H% D  M; {; Q* E$ M                我养过几种肿瘤的原代组织，但是确实没有养过食管癌组织。
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8 Z3 b0 w* ~7 O6 F& L  Q                就我的经历来看，胶质瘤的原代组织会乖乖的长成悬浮的肿瘤球，贴壁的较少。
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4 _; A! X# Q% g/ N1 z                其它的肿瘤都有不同程度的贴壁，有些会比较严重。
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                论坛里对于这个问题，大家也都有提到。解决的方法或者说改善的方法，大概有：# ]- L( I: K" }

! y, r  i0 I% p4 O* K5 L" g                1. 如果实验室条件允许，尽量用超低粘附的皿来进行培养。/ C, C. c% l7 w
# a6 k3 w: H  \+ r/ `: H
                2. 控制细胞的接种密度，稍微稀一点。1 n$ Y7 S2 N3 g# h' G; R

3 U3 w- z: `# d; p3 C, T                3. 多加一些培养基。
+ I* z) Q; r4 `: f' i0 H1 Y6 X: I$ U; M! I2 H
               你可以按照上面的方法试试看，个人觉得你是不是细胞接种的比较密。3 v1 C4 y8 X7 }

' n# r) |# Q" l$ `& b               当然我一向的观点都是尽量多看这领域的经典文献，从中找到解决问题的方法。0 P  M% Q4 p2 F# [# y- N
: y  y; p" }9 r& N( B: F( [, i1 O
               如果你认为悬浮状态的是你需要的细胞，传代时尽量轻轻的吸取培养基进行传代，贴壁的暂时可以考虑舍弃。
$ Z* E% p( X0 p" h* L% ~7 l; E& L' \
       你问我对于这个问题的解释。说实话，我还没有太想明白。  2 V! S% b7 b# x  l$ R- m7 r

# W. d7 A5 U/ ]% Y  h& H1 u' O& S       但是通常会认为贴壁的细胞可能是分化了的或者开始分化的细胞。我还在观望中。