求助关于肿瘤干细胞微球体的传代

cookiezhang

肿瘤细胞在无血清培养基中形成微球体之后，传代的时候要用胰酶-EDTA先消化，吹打形成单细胞悬液，然后离心，之后重悬分装吗？是这样做吗？
- C+ g; u& s5 t/ J 大家都要用胰酶-EDTA消化吗？

深海寂寞鱼

to cookiezhang：
# m9 h6 \  e1 R$ P0 E  x
5 I; g3 W/ M! g- J肿瘤干细胞的微球体或者说肿瘤球的传代过程大概是这样的：
/ e% v& y+ i3 p4 }0 [- i- m$ ?6 y% d
1. 离心收集肿瘤球：300g ， 5min( \' Q/ p4 K" }/ S0 u$ k
2. 弃掉培养基，用PBS重悬肿瘤球+ t2 u* f1 W4 g1 Q7 s
3. 离心后弃掉PBS
6 m' b% }' L3 m1 I6 G) \% g$ q4. 胰酶－EDTA重悬，消化肿瘤球（一般 37度，5min；可根据经验调整时间）。每1-2分钟，用手指Tap离心管底部，使细胞悬浮。$ {& O$ w4 P; [5 p' K2 I& C# I
5. 加入培养基终止消化，适度吹打使细胞进一步分散
; {  x" b: b# T5 R% C6. 离心后弃掉上清，培养基重悬，按适当密度接种。
5 n' n% a# I( n, F0 R: ~+ `- {% C, Q0 Q- o3 t  {
这只是一个大概的操作过程，其中的每一步都可以根据自己的经验，尤其是自己的细胞状态，进行相应的调整。. v+ g; u( u: ]+ b8 b% y

% A! Q. ~3 D% A) ^我现在基本上用Accutase代替胰酶－EDTA消化肿瘤球了。主观上感觉损伤好像能小一些。但是胰酶－EDTA绝对是可以用。
" S. V9 n" U: K# S" `
9 {% f0 F1 x% L你先按照这个流程试试看。如果有什么问题可以再交流。

cookiezhang

回复 深海寂寞鱼 的帖子0 l# w, L4 \% d4 Y' `1 b7 e8 B

5 r% K, ~/ W& n1 ?6 u非常感谢深海寂寞鱼。

cookiezhang

回复 深海寂寞鱼 的帖子
# d  P4 }; `4 ]0 X
! n- s4 R6 a9 W- l想请教深海寂寞鱼：培养细胞球用的细胞因子EGF、bFGF，你用的是什么公司的，是直接分装就可以用的，还是有干粉自己配制的，哪种比较合适啊？

深海寂寞鱼

回复 cookiezhang 的帖子; n' G, z' g0 x; k9 h

5 \7 l9 p; t* C, c5 q, N+ Oto cookiezhang：! F9 I" L. h- O& Y" _
& D6 P3 d, F6 B  w6 J7 @$ x
    我用的EGF和bFGF都是Peprotech公司的。都是干粉。自己配制后使用。

jamquit

回复 深海寂寞鱼 的帖子
; f1 m0 I  L5 v# P8 W* m2 l# E; l
$ R+ K( a+ f6 W' J请教下深海同学 有师兄建议我的无血清培养中除了EGF bFGF 还添加白血病抑制因子 不过我看白血病抑制因子是促进细胞分化的呀 而且像胰岛素这些需要吗？还是只是EGF bFGF B27加两抗就行了？

深海寂寞鱼

to jamquit：请问你打算培养什么细胞？然后我才可能稍微准确的回答你的问题。
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5 ]- n& ]" y% V7 _
) [" q) |( ~+ y7 q4 h) x3 h6 r- u$ e5 x/ X) F% \. V) Q4 I! X
另外，有个小建议：希望你能自己多看文献。因为任何人给你的建议都是从自己的主观出发的，适不适你，你自己必须学会判断。
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而判断的标准一般需要从你读文献中获得。
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# @; [4 |; }' W" t9 {比如，你师兄建议你不加EGF和bFGF，你就可以问问他不加的原因是什么？有什么好处，有什么缺点。加入LIF又有什么优点，可能带来什么不足？* m1 T) e2 O* y8 g+ D! Z+ x
$ ?) A0 X2 @' Y$ L2 h! W" E& G$ g
再进一步，你应该通过查找资料明白EGF、bFGF，LIF它们各自可能的作用是什么。& i  f- \% ^3 {) H. F$ g4 l
' T4 x, A9 H9 n5 p' t" F- Z
只有这样，你后面的实验才可能很好的开展。
* t. F6 }8 d1 T) M5 I- \! H+ d. Z8 A- l9 x+ U
个人的深刻感受，与你分享。希望你能明白。

jamquit

回复 深海寂寞鱼 的帖子* W2 k# X3 `; W5 O3 a( E# b8 m

6 @6 X' r' i  S0 T) q恩恩 谢谢~~~~等我再多看点儿文献了再找你探讨吧~~

lh_kitty

回复 深海寂寞鱼 的帖子- e; J+ F- B# Q* Q4 Y) s) |( e

. U+ w# E6 l# V- h% d你好，请问你培养的是什么肿瘤干细胞？我现在在养食管癌细胞，用无血清培养基养出来的细胞总是有贴壁的，传了几代之后还是有悬浮有贴壁的，不知怎么解释，想请教一下你在养细胞的时候是否遇到这种情况？

深海寂寞鱼

to lh_kitty：这种问题当然经常遇到啦。
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                我养过几种肿瘤的原代组织，但是确实没有养过食管癌组织。
0 N' l# w6 ~$ q* Y  H6 [0 s+ M- m/ q. m  L
                就我的经历来看，胶质瘤的原代组织会乖乖的长成悬浮的肿瘤球，贴壁的较少。8 e' {* B) X# u6 C9 y8 B! s' f

# l$ x' z0 X7 `! U: C# L2 I                其它的肿瘤都有不同程度的贴壁，有些会比较严重。! |( P% ^7 d) Z6 ?: q

8 \8 y5 O& `; s, ]" x                论坛里对于这个问题，大家也都有提到。解决的方法或者说改善的方法，大概有：, Y- h8 ~9 P8 l/ M4 P  x% s
- y: I5 Y4 E7 N+ ~- b
                1. 如果实验室条件允许，尽量用超低粘附的皿来进行培养。0 g( n. S, U' x+ d' M9 d2 r7 k

% t9 P2 G! g$ F+ r/ {* M                2. 控制细胞的接种密度，稍微稀一点。
: S* n1 M. @" k6 H4 C* O8 t1 \$ E* C
                3. 多加一些培养基。
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               你可以按照上面的方法试试看，个人觉得你是不是细胞接种的比较密。/ v  m: t, X) x, z

' ?& g2 c& {9 b/ ?               当然我一向的观点都是尽量多看这领域的经典文献，从中找到解决问题的方法。1 r4 w5 X9 F% D" w

3 W7 K% S- g- `6 J" M* Q; p               如果你认为悬浮状态的是你需要的细胞，传代时尽量轻轻的吸取培养基进行传代，贴壁的暂时可以考虑舍弃。
* k$ o0 ?* ?( w, U: C. n' ~) A9 t9 S) B0 m8 g0 c# M
       你问我对于这个问题的解释。说实话，我还没有太想明白。  
8 L' {) l- e+ ?' M/ o& H
' X% {: h- v  u$ W+ D% r5 M( U1 J  M" s       但是通常会认为贴壁的细胞可能是分化了的或者开始分化的细胞。我还在观望中。