求助关于肿瘤干细胞微球体的传代

cookiezhang

肿瘤细胞在无血清培养基中形成微球体之后，传代的时候要用胰酶-EDTA先消化，吹打形成单细胞悬液，然后离心，之后重悬分装吗？是这样做吗？
. K9 m# C( G& h1 ? 大家都要用胰酶-EDTA消化吗？

深海寂寞鱼

to cookiezhang：, S4 S. ~& `- r# P6 X

( d1 F2 V, z1 ?7 M1 u9 y; {肿瘤干细胞的微球体或者说肿瘤球的传代过程大概是这样的：& C9 y. o2 E( d3 ?- N+ c0 t
4 X% W9 x2 _$ x1 \& w! h" k7 q7 d. u
1. 离心收集肿瘤球：300g ， 5min/ R  x0 ^0 n8 S. I# Q' ^! c+ Z
2. 弃掉培养基，用PBS重悬肿瘤球' M% J6 H  `! ?8 _
3. 离心后弃掉PBS$ p, q% g. @( @7 H( w% A' @
4. 胰酶－EDTA重悬，消化肿瘤球（一般 37度，5min；可根据经验调整时间）。每1-2分钟，用手指Tap离心管底部，使细胞悬浮。. z( [0 O0 B. N( L9 R0 s+ J, i+ P
5. 加入培养基终止消化，适度吹打使细胞进一步分散
! z; Y) K# k% n* }3 ^6. 离心后弃掉上清，培养基重悬，按适当密度接种。- u( Y* ]( Q, |5 o. K
# Z) o: S; ]1 P6 E0 w5 h
这只是一个大概的操作过程，其中的每一步都可以根据自己的经验，尤其是自己的细胞状态，进行相应的调整。
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7 h3 s' Y8 y& W! t, O8 P, U# }% H我现在基本上用Accutase代替胰酶－EDTA消化肿瘤球了。主观上感觉损伤好像能小一些。但是胰酶－EDTA绝对是可以用。
  K. n2 f/ Y' N& ?. }9 c6 }: [0 W1 ?  P4 m
你先按照这个流程试试看。如果有什么问题可以再交流。

cookiezhang

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! t9 \7 q/ E, U0 v9 R0 m. U6 M9 q/ r# E7 a0 n
非常感谢深海寂寞鱼。

cookiezhang

回复 深海寂寞鱼 的帖子# l  w' J+ v7 z

. }) {4 x8 ~4 s% m想请教深海寂寞鱼：培养细胞球用的细胞因子EGF、bFGF，你用的是什么公司的，是直接分装就可以用的，还是有干粉自己配制的，哪种比较合适啊？

深海寂寞鱼

回复 cookiezhang 的帖子! J; [$ ~, R  a4 H

7 N3 I$ j4 g4 Y9 jto cookiezhang：) l" r  g' N/ C& P6 i1 d
( m4 |' C2 g# i  Q
    我用的EGF和bFGF都是Peprotech公司的。都是干粉。自己配制后使用。

jamquit

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0 Q$ g. v; u9 s3 }1 {& R
7 Z  q3 Z# v% q& r4 _请教下深海同学 有师兄建议我的无血清培养中除了EGF bFGF 还添加白血病抑制因子 不过我看白血病抑制因子是促进细胞分化的呀 而且像胰岛素这些需要吗？还是只是EGF bFGF B27加两抗就行了？

深海寂寞鱼

to jamquit：请问你打算培养什么细胞？然后我才可能稍微准确的回答你的问题。) z9 H9 n8 m& k9 K2 S% E
  C$ q2 P6 \$ U) w+ Q8 o3 D

- S3 P* A4 d( y* n: r5 y+ h! T5 \5 `1 x7 e6 e
另外，有个小建议：希望你能自己多看文献。因为任何人给你的建议都是从自己的主观出发的，适不适你，你自己必须学会判断。1 r7 ^9 [2 P2 P1 E! W3 Y
* j; V8 |- \" w7 d8 m( }
而判断的标准一般需要从你读文献中获得。
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6 k  C: Q4 U: V5 F, C; H# ?6 l比如，你师兄建议你不加EGF和bFGF，你就可以问问他不加的原因是什么？有什么好处，有什么缺点。加入LIF又有什么优点，可能带来什么不足？  W- m% O! d6 ?& @
) H* i$ |- j. L6 h' j
再进一步，你应该通过查找资料明白EGF、bFGF，LIF它们各自可能的作用是什么。. s1 v: w5 N" J4 N

- ~0 G# h- h# ]; |( p只有这样，你后面的实验才可能很好的开展。
0 k2 J: {* x2 H% P# Q$ ?) l' a6 d6 H+ A. B$ B- {# ?# H
个人的深刻感受，与你分享。希望你能明白。

jamquit

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1 ^4 j" n/ ~& ^9 p" V1 c& u  d$ C, Y5 _
恩恩 谢谢~~~~等我再多看点儿文献了再找你探讨吧~~

lh_kitty

回复 深海寂寞鱼 的帖子) a5 s, i+ @9 |1 M! O8 u2 H* Q$ x

$ O; _" b) R( w+ X# W, ~% n) v你好，请问你培养的是什么肿瘤干细胞？我现在在养食管癌细胞，用无血清培养基养出来的细胞总是有贴壁的，传了几代之后还是有悬浮有贴壁的，不知怎么解释，想请教一下你在养细胞的时候是否遇到这种情况？

深海寂寞鱼

to lh_kitty：这种问题当然经常遇到啦。6 {3 w* {0 k8 J& O1 W

/ v7 s3 d; l9 R4 x8 \                我养过几种肿瘤的原代组织，但是确实没有养过食管癌组织。" P0 A. j, ~4 K2 G6 {% H9 L

/ d! I: O% H- L$ @; g                就我的经历来看，胶质瘤的原代组织会乖乖的长成悬浮的肿瘤球，贴壁的较少。* _% M( W' G9 T3 M) Q3 {7 ?

, O/ U: P- c, I& _* S: e- X' a  ~                其它的肿瘤都有不同程度的贴壁，有些会比较严重。
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                论坛里对于这个问题，大家也都有提到。解决的方法或者说改善的方法，大概有：
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                1. 如果实验室条件允许，尽量用超低粘附的皿来进行培养。
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                2. 控制细胞的接种密度，稍微稀一点。  U7 E! N2 r' T$ s2 T' ^2 `- r
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                3. 多加一些培养基。- K' s" m) [2 b$ h( r% B# X
) Q) Q$ q, |3 w& p. ]! r7 U
               你可以按照上面的方法试试看，个人觉得你是不是细胞接种的比较密。) w" Z6 F' r0 v; H
5 l% T* J) c& u0 D5 d
               当然我一向的观点都是尽量多看这领域的经典文献，从中找到解决问题的方法。
7 m+ k3 h5 y& w/ _! E& b2 S5 p7 K2 a: N
               如果你认为悬浮状态的是你需要的细胞，传代时尽量轻轻的吸取培养基进行传代，贴壁的暂时可以考虑舍弃。- f0 P3 b. n5 L3 ]- J8 b: W: V

0 I1 b$ c5 j  f) q9 M! e' ?4 U) w! N       你问我对于这个问题的解释。说实话，我还没有太想明白。  & M1 B' N9 k4 u! P8 [

: y, b& Z7 Y$ C8 T2 c- x       但是通常会认为贴壁的细胞可能是分化了的或者开始分化的细胞。我还在观望中。