pri-miRNA的超表达能用pEGFP-C1吗？

runsong

1 g- P; b, j" V0 L
& C6 z# q, T  P+ g! g
本人想做miRNA的超表达，而且想在表达miRNA的细胞中共表达egfp等标记基因，原理如图所示。
0 ~! m& l" @6 E3 X但有几个问题想求教各位前辈7 V; i8 q) }' @' `& c( t' t
1、由于pri-miRNA与编码egfp的mRNA是相连的，我不知道pri-miRNA在加工为pre-miRNA的过程中，对egfp的表达有无影响。8 Z% W# _+ ~- K: W+ |+ r
2、如果有（我想会有），能否留下能够表达egfp的mRNA。miRNA与egfp的表达能否兼容。, g% _) f0 A" z0 z2 [/ j

runsong

本人想做miRNA的超表达，而且想在表达miRNA的细胞中共表达egfp等标记基因，原理如图所示。
5 R3 y3 e* F( f( H& p7 q$ J但有几个问题想求教各位前辈5 q) U4 M8 [6 Y6 y" d
1、由于pri-miRNA与编码egfp的mRNA是相连的，我不知道pri-miRNA在加工为pre-miRNA的过程中，对egfp的表达有无影响。: e& V: `3 I( `1 M5 `
2、如果有（我想会有），能否留下能够表达egfp的mRNA。miRNA与egfp的表达能否兼容。% G* k- U; S' v: f# s) |1 j

深海寂寞鱼

to runsong战友：; Q' Z2 H8 r3 F0 h5 A8 D, l3 L1 K7 s

& x. h2 H/ I( G  e2 t! Z8 h! D   你的这个设想是完全可以实现的。我们实验室就是这么做的。
& f0 X  n$ ~. V0 j
4 E; p% C/ m+ a$ c" O5 D   有两点需要注意：
( o( a7 c1 D* L! S  r/ N9 N
) I9 @0 g3 l8 `& W( z   1. 因为pEGFP-C1载体最初是设计用来做C端融合表达的，EGFP的末端没有没有终止密码子，它的终止密码子在多克隆位点的3`端。
# c9 S) x( G* g" A8 y- d   
, h3 y: ~, u( }! G. S       因此如果你想把你的pri-miRNA插入到多克隆位点之中，就要注意在pri-miRNA的5`端加上终止密码子。
9 }* ~8 ^0 J  V( F, s" s
/ o% P2 E( r4 s/ L# N. U       我是用BsrG I和另一个限制性内切酶将pEGFP-C1切开，然后插入pri-miRNA。- m/ S; }6 v, r* ^
0 d/ l* F: M5 S# U9 A
       由于BsrG I切开时，会切掉EGFP的几个碱基，所以会在pri-miRNA的5`端补上这几个碱基，并且加上终止密码子。
5 S; d4 Y. O; d5 a4 p% f0 i4 d
/ ~, f9 W; m$ j0 ]       这样做的最大的好处就是不会使EGFP多任何一个碱基。
: A& s1 D( Q# m
' B0 x% d  N5 d1 m( J* C/ I    2. 在克隆pri-miRNA时注意克隆的长度，以防pri-miRNA不能被加工成熟。- _3 K6 t* Z0 `- O- Q

% z& k* j; `, p大胆的做吧。这个不会太难的。 如果有问题可以继续交流。

runsong

跪谢大神指点

siyue13

寂寞鱼解释得好详细，膜拜一下

runsong

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9 K; g* h1 U( H: N- w' }" R
/ o. S" w0 R- l" @5 a5 A! p5 @非常感谢您的指导，但我还有三个问题想再向您请教、确认：
9 P4 O% X% o% M1、若不在pri-miRNA前加终止密码子，GFP与miRNA也是会正常表达的，但GFP后会融合一个由pri-miRNA编码的小蛋白，有可能产生不可预知的结果，干扰试验。) K  S9 l: F; S6 C5 U& O
2、GFP是由未被卷入pre-RNA加工过程的mRNA翻译而来的。其数量要少于pEGFP-C1空载体的GFP表达量。
' X! V- D# X' z1 V3、pri-miRNA克隆的长度有何硬性规定，前后各延伸100可以吗？
0 U1 M7 J' t# R5 I- \4、能否给我几篇您已发表的文章供在下学习借鉴。
& }5 m* M2 \4 h1 W9 L2 e最后祝您好人好运好心情！

深海寂寞鱼

. c- z7 G' Z- t- i
0 X6 u/ Z5 G  `+ R
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  a( S5 f  \5 h9 g1 o' [! R- ^: e* V
to runsong兄：" \* `2 {+ @' C; L% e$ V, N

* Y$ i0 m, d9 `. O8 m    指导压根谈不上，论坛就是让大家交流学习的，你太客气了。
+ ~; E3 C. ~% _# l. j4 W
3 C/ h, {7 a4 K; j% D    对你的问题回答如下：9 S/ O, A5 I% F9 z- Z: x( H; s5 @
1 v2 h% _( V8 h3 ~
    1.  若不在Pri-miRNA前加终止密码子，GFP与miRNA确实都能被转录，miRNA也应该能成熟；但是GFP能不能被翻译成正确的蛋白，那就不一定了。因为翻译的过程必须要有终止密码子才能完成。你想想，pri-miRNA从mRNA链上剪切掉以后，GFP的mRNA或许就没有终止密码子了。因为载体上能提供的那个终止密码子在多克隆位点的3`端，在你的miRNA后面。# J5 v6 L( h) |3 r/ b0 d

$ D; \8 x! {1 Z  X6 k% q         当然如果你不想让你的载体在表达miRNA的同时也表达GFP的话，你说的方法也可以。
$ b5 x9 V% x- [3 O. A* x1 y9 R- c" \
       而且就你说的，如果不加终止密码子，还可能会产生融合蛋白（由GFP和pri-miRNA编码的小蛋白融合）。
" N4 ^7 E% _' f9 s* ^3 E0 B- E) x1 ^8 s6 `" u! t- F2 n
        所以，你为什么不考虑直接加上终止密码子呢？希望我讲明白了。& d, H% [- [) o$ G2 a3 n/ p
, p. g: E4 Z! S! |2 e% F- @8 R
      2. 如果加入终止密码子的话，GFP和miRNA的表达比例可能不会低于1:1。2 ?- g. R0 B! r( z2 U

5 m- K& h- Y* d$ T$ j# v4 E9 i3 w, c          因为1条mRNA链未必只翻译成一条多肽链，有时mRNA可能多次翻译。（比如人泌乳时酪蛋白的翻译）。
/ s7 e/ R7 s1 [9 U' _   
8 h( |. \* l& K0 H- k& \  m9 w          GFP mRNA链会被翻译几次不好说。但是与miRNA比的话，至少也是1:1.
/ s9 [4 h" B7 \: M; j   
# `, ]9 ], [7 a/ F       3. pri-miRNA克隆长度有没有硬性规定，我还没有看到文献。一般来说前后各延伸100nt应该是可以的。% N: N- |% i# p" o% P3 l% e
        
  s6 s' y9 h8 p+ k" l8 [% X. B% e9 k            不过你最好看看你具体要研究的miRNA的文献，看看他们构建时前后各取了多长。( j6 G5 v9 F, e4 S( b( @% ]3 Y

2 c- Z7 R3 l8 k4 ^, F( q* p: ]% \            或者看看你的miRNA是位于基因的什么位置？它是独立的基因表达？或者是某个基因的内含子？  2 d0 I7 X, k5 W& g" X  P
) O" B" f8 c# R2 @, i! R

' T: E: A% I' ~3 _: _8 j9 d         4. 我目前没有这方面已经发表的文章。
3 Y) j7 D6 ]0 Z+ Q7 d; A: B- O  
# E  o( z9 a2 u9 b, C# \, O9 {             但是我们构建的miRNA表达载体，在转染细胞后，real-time PCR都能检测到成熟miRNA的表达。
+ C! _( l" q' z3 P$ o/ y+ d/ B- y. g0 _5 Y
' E: B% }5 U! c& F5 d
            最后，也祝你实验顺利，天天开心。
: V3 J4 N% ^! n  w& j3 m/ O3 X

runsong

回复 深海寂寞鱼 的帖子% T$ I2 I1 @" R& Q- P, U, d4 l, C7 t
- x- q$ [0 S* T( f; k
我画的这幅图有错误吗
" N: O0 S+ _: b( {6 G

深海寂寞鱼

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0 C, a2 e1 o, F8 T' P3 I& R; `. U5 r2 `9 R" P1 W1 B3 R9 ]/ e6 d
呵呵 ， runsong兄，你绝对是个天才。
7 I% c6 G5 I0 ?3 Q# g$ X2 @* w* s$ d, b0 w" [+ Y* ]
我也很喜欢画图来说明问题) `+ `+ |8 {' a# a# S6 U" c
4 ^0 U- `% J3 L7 w5 P3 }& e* C
不过跟你一比，我差的就太远了。5 I% j  S& p6 L; C, I" b) s

! p& E0 J8 A5 r你的图怎么画，教教我啊。
' X9 ]' }! w% @4 R9 U
2 I2 L6 n# Z# k3 M+ e' ?% u貌似你要做miRNA-34 ?   呵呵。。。。。好像文章不少啊。还有个miRNA-21在肿瘤方向的文章也不少。

runsong

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- j! `( d% k& L- L8 z$ M4 @; T4 J0 j& k$ n  l" {
载体图是用clone maneger画的  其他一切操作用的都是PPT或PS  
. M7 R1 g$ Y2 }9 {& ^0 z我是土八路，信手涂鸦