利用小分子复合物诱导出ipsc原文及简析

zerollx

    体细胞的重编程可通过 Oct4/Sox2/Klf4/c-Myc or Oct4/Sox2/Nanog/LIN28的病毒转染法而实现，最近又有报道仅用 Oct4/Klf4便将神经祖细胞重编程为ipsc，这是因为NPC可内源性表达OCT4.这篇研究中，我们用小分子BIX-01294 and BayK8644联合病毒转染Oct4/Klf4入小鼠的成纤维细胞，该细胞没有相关的内源性基因的表达，也得到了ipsc，说明通phenotypic screen得到的小分子能够替代病毒转染用的一些因子如OCT4，并且提高了重编程的效率（相比于去掉c-Myc的Oct4/Sox2/Klf4方法）
+ n0 W0 G0 i; M$ D. a6 I, O        BIX 与Bayk 的作用机制：
, Q7 g; W: x) |' }9 K   1、BIX: 在NPC的诱导试验中，进一步的研究表明在此过程中，G9a histone甲基转移酶受到抑制(G9a HMTase)后，重编程的水平大大提高了，BIX便是G9a HMTase的一种抑制剂，
  G( c4 V5 g3 {% S' F. N, Q% d  Y/ R% N
    2、Bayk 是一种L-channel calciumagonist，它并不引起表观修饰，而是在信号转导方面起重要作用。L-type calcium channels 在细胞内的不同组织内介导一系列的过程，如blood pressure regulation, smooth-muscle contractility, insulin secretion, cardiac development, 其通过CREB作用使Ca2+释放，改变cAMP水平，此外，Ca2+在mESCDE 增殖过程中也有着重要作用。
$ k8 r% x9 ~/ Z: Q        " k0 W3 H( l+ E: X  u/ E
        BIX-01294 、BayK8644、Oct4和Klf4共同作用与小鼠的成纤维细胞的结果：
+ w: y* Z2 z2 T3 C        仅用OCT4和Klf4得到的ipsc形态不明显，ALP也很弱，而且无法扩增，. s$ Z. ?& w" }6 r% E
        用OCT4和Klf4加上BIX处理，在此之后的14-21天内，得到强表达ALP的克隆，而且Nanog, Oct4, and SSEA-1也呈阳性，但其诱导率明显低于 Oct4/Sox2/Klf4/c-Myc 4因子诱导和OCT4、Klf4、BIX联合诱导 NPC的过程，这个结果表明表观修饰在重编程的过程中也起着重要的作用。! K/ ~7 i8 [1 |4 o9 N. B# n9 e
        在OCT4和Klf4加上BIX的基础上，又添加了其它的小分子，结果又发现了5-azacytidine、RG108和BayK，前二者与BIX相似，是 DNA methyltransferase的抑制剂，后者是一种L-channel calciumagonist，它并不引起表观修饰，而是在信号转导方面起重要作用，而且在无BIX处理的过程中，单纯依靠OCT4、Klf4和BayK是无法引起重编程的。
$ g5 h! B) i4 j        8 U7 |  v9 R# ~% _% ]1 u; d9 X/ o
        进一步确定其多能性: J1 S" w* ^$ S) M% G6 L! x
        用含Oct4-GFP reporter的MEF为材料，结果与上述相似，即仅用OCT4和Klf4、用OCT4和Klf4加上BIX处理时得到很少的克隆。用OCT4和Klf4加上BIX、BayK处理时得到较多的克隆，单纯依靠OCT4、Klf4和BayK无克隆形成。
& Z3 \  e4 R/ Z# P' b4 w1 l5 q        检测其多能性：
" ~) F& S2 h; }% f1、DAPI、APK染色和 RT-PCR显示这些GFP+OK2B iPSCs 表达了典型的多能性标记： ALP, Nanog, Sox2, Oct4,SSEA1, c-Myc, eRas, Esg1, Ecat1, and Fgf4.
, K. O4 O) W  {( x2、Bisulphite genomic分析Nanog 启动子的去甲基化程度与ESC相当，与MEF想去甚远。
0 H7 E2 a5 S' C0 \3、Transcriptome分析analysis showed that expression profile of OK2B iPSCs is greatly similar to the one of mESCs with a Pearson correlation value of 0.96, while significantly different to MEFs’ profile with a Pearson correlation value of 0.84 as exemplified in the clustering analysis
: _6 F. [3 |9 M% W; J" u; l! Q. b9 _4、分化潜能:
8 R5 G# X6 x& l$ e) l3 g0 q      （1） 类胚体实验：对得到的EB用DAPI染色，显示三胚层均有分化：内胚层 (Albumin and Pdx1),中胚层 /心肌(CT3), 外胚层/neurons (bIII-tubulin, Tuj1).: \# ~  {% t; |' [
      （2）2N囊胚注射：将ipsc注入8细胞期的囊胚中，再移植入同期的小鼠子宫中得到嵌合体小鼠，将得到的一个雄性嵌合体小鼠与野生型雌鼠杂交，得到的后代小鼠中得到了有LacZ+和Oct4-GFP+细胞的小鼠，说明该ipsc能整合到生殖系产生精子，证明了其全能性。

stonelee2050

可不可以具体的介绍一下你们的方法呢？具体步骤哦。

flydayzhu

被忽悠了，还以为是完全chemical的。。。。。

zerollx

回复 flydayzhu 的帖子
& o5 X. M1 e& F5 {8 r
7 i% t( c  i3 J9 u呵呵，那篇文章我也想要啊……

钻石星辰

你介绍的是08年Cell stem Cell上的文献。
! Y0 I7 |) t  D- ?* t. }0 l' d4 z7 q- G* [
目前iPS领域研究热点之一就是利用small molecules替代transcription factor，或者尽可能减少transcription factor的种类，特别是c-myc和klf4。
: F* y, K) q( {
; a) G" ]! v. }% ]现在最新的文献已报道联合small molecules compounds可以仅仅导入单个转录因子Oct4就可诱导出iPS，不过效率很低。

zerollx

回复 stonelee2050 的帖子
& S0 K# q3 J2 N4 [& Z9 V7 _* y% g2 ]- c) a7 s! S
这个文献里面有，仔细看看就知道了

flydayzhu

回复 zerollx 的帖子. i$ u) g- V" M  q: q8 a: H

8 k2 j8 }, f) p: K# y: ], F. f: C1 w恩，谢谢~

scienese

老兄的题目有点歧义啊！

zerollx

嗯，没注意与最新的那篇文章区别开来，下次一定注意！！！！

fantafiction

请问BIX 与Bayk如何筛选找到的?